PROGRAMA-HORARIO

MIÉRCOLES 21/02/2001

9:00-12:00 Inscripción

12:00 Apertura

12:15 - 14:00 CONFERENCIAS GENERALES

MODERADOR: Prof. S. Grisolía

12:15 VECTORES VIRALES: VIRAL VECTORS IN GENE THERAPY

Olivier Danos, (Presidente de la Sociedad Europea de Terapia Génica )

13:00 VECTORES NO VIRALES: VECTORES NO VIRALES EN TERAPIA GÉNCIA

Salvador F. Aliño (Departamento de Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia)

14:00 15:30 Comida

15:30 17:15 SESIÓN: VECTORES

MODERADORES: Dr. O. Danos y Dr. G. Hortelano

15:30 VECTORES RETROVIRALES PARA TERAPIA GÉNICA DE SUSTITUCIÓN.

Humberto Sánchez. Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" CSIC-UAM. Madrid.

15:45 TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIANTE VECTORES VIRALES PARA DIRIGIR LA EXPRESION DE GENES EXOGENOS A ISLOTES PANCREATICOS IN VIVO.

Miguel Chillón. Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria; Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Universitat de Barcelona.

16:00 DESARROLLO DE UN NUEVO VECTOR RETROVIRAL SUICIDA PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED EN TRASPLANTE ALOGENICO DE MEDULA OSEA.

José C. Segovia. Programa de Terapia Génica. CIEMAT/ Fundación M. Botín. Madrid.

16:15 Identificación de distintas clases de células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas por su capacidad proliferativa y de automantenimiento

Guillermo Guenechea^1,2. Programs in Cancer/Blood Research and Gene Therapy, Hospital for Sick Children and Department of Molecular and Medical Genetics, University of Toronto, Canada, ²Gene Therapy Program, CIEMAT/Fundación Marcelino Botín, Madrid.

16:30 TRANSFERENCIA SELECTIVA DE GENES CON UN VECTOR NO VIRAL DIRIGIDO DE BASE POLIMÉRICA EN UN MODELO DE LINFOMA HUMANO.

Vicent M Guillem¹^,2.1 Grup de Teràpia Gènica. Dpt. de Farmacologia. Facultat de Medicina. 2 Servei d Hematologia i Oncologia. Hospital Clínic Universitari. Universitat de Valencia.

16:45 FRAGMENTO C DE LA TOXINA TETÁNICA: UN NUEVO VECTOR PARA LA TERAPIA GENICA DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS.
Rosario Osta. Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos. Universidad de Zaragoza.

17:00 EFFICIENT GENE DELIVERY BY IMPROVED TRANSFERRIN-LIPOPLEXES

Concepción Tros de Ilarduya. Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, School of Pharmacy, University of Navarra. Pamplona.

17:15 17:45 Café

SYMPOSIUM FUNDACIÓN MARCELINO BOTÍN

17.45-19.45 SESIÓN: TERAPIA GÉNICA DE TEJIDOS SOMÁTICOS

MODERADORES: Dr. J.L. Jorcano y Dr. J.A. Bueren

17:45 ADVANCES IN THE GENE THERAPY OF HEMATOPOIETIC STEM CELL DISEASES.

Juan A. Bueren. Departamento de Biología Celular, Molecular y Terapia Génica. CIEMAT y Fundación Marcelino Botín para Terapia Génica. Madrid.

18:15 REGENERATION OF ISCHEMIC CARDIAC MUSCLE AND VASCULAR ENDOTHELIUM BY ADULT STEM CELLS

Kathyjo A. Jackson. Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA.

18:45 DELIVERY OF THERAPEUTIC ANGIOGENIC GENES

Matthew L. Springer. Dept. of Molecular Pharmacology, Stanford University School of Medicine, USA

19:15 CORRECCIÓN DEL SÍNDROME DE OBESIDAD Y DIABETES DE RATONES ob/ob MEDIANTE TRASPLANTE DE QUERATINOCITOS PRODUCTORES DE LEPTINA.

Fernando Larcher. Departamento de Biología Celular, Molecular y Terapia Génica. CIEMAT y Fundación Marcelino Botín para Terapia Génica. Madrid.

19:45 Cocktail de bienvenida

JUEVES: 22/02/2001

8:30 - 9:15 CONFERENCIA GENERAL

MODERADOR: Dra. Fátima Bosch

GENE THERAPY OF MONOGENIC DISEASES: HEMOPHILIA AS A MODEL

Gonzalo Hortelano. McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada.

9:15 10:30 SESIÓN: ENFERMEDADES METABÓLICAS

MODERADORES: Dra. Fátima Bosch y Dra. Cristina Fillat

9:15 NIVELES TERAPÉUTICOS DE FACTOR VIII (FVIII) HUMANO EN RATONES IMPLANTADOS CON CÉLULAS RECOMBINANTES ENCAPSULADAS

Carmen García-Martín^1,2.¹Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada; ²Unitat de Recerca, Centre de Transfusió i Banc de Teixits, Barcelona;

9:30 GENE CFTR TRANSFER AND PERSISTENCE OF EXPRESSION OVER TIME

Marta Benet. Dpto. Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia.

9:45 EXPRESIÓN DE INSULINA POR EL MÚSCULO ESQUELÉTICO MEDIANTE VECTORES ADENOASOCIADOS (AAV) Y ELECTROTRANSFERENCIA IN VIVO.

Alex Mas. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Universidad Autónoma de Barcelona.

10:00 NORMALIZACIÓN DE LA GLUCEMIA EN RATONES DIABÉTICOS TRAS TRANSPLANTE DE CÉLULAS MUSCULARES QUE EXPRESAN GLUCOQUINASA.

María Ontiveros. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica. Universidad Autónoma de Barcelona.

10:15 PERMANENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA IN VIVO EN TRASPLANTES DE QUERATINOCITOS HUMANOS TRANSDUCIDOS POR VECTORES RETROVIRALES.

Marcela Del Río. Departamento de Biología Celular, Molecular y Terapia Génica. CIEMAT y Fundación Marcelino Botín para Terapia Génica. Madrid.

10:30 11:00 Café

11:00 12-30 SESIÓN: SILENCIAMIENTO GÉNICO

MODERADORES: Dr. Ramón Eritja y Dr. Jordi Gómez

11.00 LA ESTRATEGIA ANTISENTIDO DESDE UNA PERSPECTIVA QUIMICA.

Ramon Eritja. Instituto de Biología Molecular de Barcelona, C.S.I.C. Barcelona.

11:15 EFECTO CITOTÓXICO EN CÉLULAS HUMANAS DE CÁNCER DE MAMA DE INMUNOLIPOSOMAS TRANSPORTADORES DE OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO CONTRA EL RNA PARA LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA.
Carlos J. Ciudad. Facultad de Farmacia. Universitat de Barcelona . Barcelona

11:30 SPECIFIC INHIBITION OF BCR-ABLP190 CELLS BY RETROVIRALLY TRANSDUCED ANTISENSE TRANSCRIPTS IN TRANSGENIC MICE
Arantxa Rodríguez-García. Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer. CSIC/ Universidad de Salamanca.

11:45 INGENIERÍA DE RIBOZIMAS.

Alfredo Berzal-Herranz. Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC. Granada

12:00 INACTIVACION FUNCIONAL DE CCR5 MEDIANTE TRANSFERENCIA GENICA RETROVIRAL.

Jose Luis Abad. Departamento de Inmunología y Oncología. Centro Nacional de Biotecnología. Universidad Autonoma de Madrid.

12:15 Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC) mediante la RNasa P humana

Anna Nadal. Departamento de Medicina Interna-Hepatología, Hospital Vall d'Hebrón, Barcelona.

12:30 14:00 Sesión de Posters.

14:00 15:30 Comida

SYMPOSIUM FUNDACIÓN BBVA

15:30 17:00 CONFERENCIAS GENERALES

MODERADOR: Dr. Jesús Prieto

15:30 CÁNCER: STRATEGIES TO ADAPT ADENOVIRUS FOR CANCER GENE THERAPY APPLICATIONS

David Curiel. Director de la División de Terapia Génica, UAB, Alabama. USA.

16:15 VACUNAS GENÉTICAS: DNA VACCINES

Margaret Liu. Senior Advisor in Vaccinology, Bill & Melinda Gates Foundation and Vice-Chairman, TRANSGENE.

17:00 17:30 Café

17:30 19:15 SESIÓN: CÁNCER Y VACUNAS GENÉTICAS.

MODERADORES: Dr. Jesús Prieto y Dr. David Curiel

17:30 ADENOVIRUS MEDIATED GENE TRANSFER OF INTERLEUKIN-12 (IL-12) AND INTERFERON GAMMA INDUCIBLE PROTEIN 10 (IP-10) DISPLAYS POTENT ANTITUMOR EFFECTS.

Iñigo Narvaiza. Unidad de Terapia Génica. Dpto. de Medicina Interna. Universidad de Navarra. Pamplona

17:45 RETROVIRUS-MEDIATED TRANSFER OF THE HERPES SIMPLEX VIRUS THYMIDINE KINASE AND CONNEXIN 26 GENES IN PANCREATIC TUMOR CELLS. IMPLICATIONS FOR GENE THERAPY.

Cristina Fillat. Centre Genètica Mèdica i Molecular, (IRO).L'Hospitalet de Llobregat. Barcelona.

18:00 ADENOVIRUS-MEDIATED EXPRESSION OF TUMOR SUPPRESSOR GENES (p53, p16, p21 and pRb) IN HUMAN PANCREATIC CELL LINES WITH DIFFERENT PATTERN OF GENETIC ALTERATIONS.

Manel Cascalló. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universitat de Barcelona.

18:15 STRATEGIES TO ACCOMPLISH TARGETED EXPRESSION OF TRANSGENES IN OVARIAN CANCER FOR MOLECULAR THERAPEUTIC APPLICATIONS.
Enrique Casado. Servicio de Oncología Médica, Hospital La Paz, Madrid.

18:30 DEMOSTRACIÓN DE SINERGIA IN VITRO ENTRE VECTORES ADENOVIRALES RECOMBINANTES PRODUCTORES DE INTERFERON g O FACTOR DE NECROSIS TUMORAL a Y AGENTES QUIMIOTERÁPICOS.

Ignacio García Ribas. Department of Cancer Research/ICRF Unit. St Thomas Hospital. Londres. UK.

18:45 GENE THERAPY OF ORTHOTOPIC HEPATOCELLULAR CARCINOMA IN RATS USING ADENOVIRUS CODING FOR INTERLEUKIN-12 (IL-12)

Miguel Barajas. Laboratorio de Terapia Génica del Cáncer. Departamento de Medicina Interna. Universidad de Navarra. Pamplona

19:00 ESPECIFICIDAD, EFICACIA Y SEGURIDAD DE UN SISTEMA DE PURGADO IN VIVO, PARA LA ELIMINACIÓN DE ENFERMEDAD TUMORAL RESIDUAL EN PRODUCTOS HEMATOLÓGICOS UTILIZADOS EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA
Rosa María Lillo. Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. Madrid

19:15 MESA REDONDA: Proyección Clínica de la Terapia Génica

MODERADOR: Dr. Juan Ruiz

Dr. Vicente Guillem: Presidente Sociedad Española de Oncología

Dña. Soledad Ruiz: Agencia Española del Medicamento

Dña. Lucía Roda: Dirección General de Calidad y Evaluación Ambiental

20:15 Clausura

20:30 REUNIÓN DE LOS SOCIOS DE LA S.E.T.G.

CONFERENCIAS PONENTES INVITADOS

Conferencia 1

VIRAL VECTORS FOR GENE TRANSFER: TRENDS AND PROGRESSES

Olivier Danos.

Genethon III, CNRS URA 1923 Evry. France

Over the past few years, the field of gene therapy has placed a strong emphasis on vector research. This resulted from the outcome of the first series of clinical trials as well as from accumulated pre-clinical data. These collectively indicate that although the concept of gene therapy is valid, the tools we have in hand are far from being efficient enough. Three successive levels of problem exist. First, much fundamental investigation on the mechanism of gene transfer is needed and novel types of vectors have to be engineered. Second, the vector research must be linked to the development of optimised procedure for the production of reagents to be used in clinical trials. Finally, production facilities accessible to the scientific community must be organized. This presentation will discuss the most significant progresses in viral vectors development (retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses), and the current efforts designed to facilitate access to high quality vectors to investigators with a gene therapy project.

Conferencia 2

VECTORES NO VIRALES EN TERAPIA GÉNICA

Salvador F. Aliño

Dept. de Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia.

La terapia génica es una nueva estrategia terapéutica basada en la utilización de los ácidos nucleicos como medicamentos y/o dianas terapéuticas. En última instancia, la terapia génica supone la incorporación de los ácidos nucleicos en de la célula con el fin bien de aumentar el número de genes, bien de bloquear o silenciar la expresión de los mismos o bien con la intención de reparar posibles mutaciones. En todo caso, la transferencia génica requiere el concurso de vectores, los cuales en la actualidad se dividen en dos grandes grupos: virales y no virales, dependiendo de la estrategia seguida para incorporar los genes en la célula. Mientras que los primeros destacan por su eficacia, los segundos lo hacen por su seguridad en relación con la aparición de reacciones adversas. Los sistemas no virales pretenden mimetizar los mecanismos de entrada y liberación viral del gen pero evitando los riesgos patogénicos de los mismos. Se han desarrollado múltiples estrategias, las cuales pueden ser agrupadas en aquellas basadas en la utilización de lípidos , fundamentalmente formación de complejos, lípidos catiónicos y/o liposomas clásicos, y las basadas en polímeros como polipéptidos, polietileneimina, dendrímeros, terplex, etc. Los complejos más ampliamente utilizados son los lipoplejos y los poliplejos, basados en las interacciones de carga del DNA (de carácter aniónico) con lípidos o polímeros catiónicos, respectivamente. Estos complejos permiten la entrega celular de genes exógenos con una eficacia relativamente alta y en modelos in vitro, es posible estudiarlos como si se tratase de medicamentos, de acuerdo con curvas dosis respuesta, permitiendo llegar a caracterizar los parámetros de Potencia y Eficacia del vector, los cuales vienen definidos por la dosis que conduce al 50 % del efecto máximos y la respuesta máxima alcanzada en la curva, respectivamente. Otro parámetro de interés para su caracterización es la Disponibilidad Nuclear, que puede ser obtenido por PCR cuantitativo y que informa de la proporción de ácido nucleico trasferido que es capaz de llegar funcionalmente activo al núcleo.

Desde el punto de vista de las aplicaciones terapéuticas, los sistemas no virales pueden utilizar (al igual que los sistemas virales) dos grandes estrategias: los modelos ex vivo y los modelos in vivo. En el primer caso, las células son aisladas del organismo con el fin de ser modificadas genéticamente y posteriormente transplantadas. Los experimentos llevados a cabo transfiriendo genes inhibidores de la angiogénesis ponen de manifiesto que las células modificada genéticamente y seleccionadas para expresar genes de esta naturaleza de forma constitutiva son capaces de inhibir la progresión de los tumores inducidos experimentales y que además estos efectos se acompañan de un incremento en la supervivencia de los animales. De un modo similar, la modificación genética de células tumorales con vectores no virales, con el fin de expresar de forma constitutiva genes de interleuquinas, permite desarrollar vacunas antitumorales de alta eficacia y conduce al convencimiento de que es posible alcanzar grados de respuesta de rechazo del tumor del 100% en modelos experimentales tumorales. Estas observaciones, ponen de manifiesto que si bien estos vectores son menos eficaces que los sistemas virales, también es cierto que en muchas ocasiones llegan a alcanzar la misma utilidad terapéutica. En las estrategias in vivo, los requerimientos del vector son mas exigentes y su diseño depende de la diana o destino final asignado al vector. Un ejemplo es el caso de la trasferencia de genes a los hepatocitos, cuya principal limitante es la superficie del endotelio vascular. En este sentido, el endotelio del sinusoide hepático presenta unas fenestraciones o poros de unos 100 nm de diámetro y por tanto solo los vectores que dispongan de una dimensión menor al mismo podrán abandonar, a través del poro, la circulación sistémica para alcanzar al hepatocito. Con el fin de mejorar selectividad en la entrega del gen y simular mejor el comportamiento de los sistemas virales, es posible incorporar a los vectores ligandos o anticuerpos que permitan dirigirlos hacia territorios o tejidos selectivos. En este sentido, nuestro grupo ha trabajado en la incorporación de asialofetuina como ligando en liposomas de pequeño tamaño con el fin de dirigirlo hacia el hígado, confirmando que con este procedimiento se consigue una expresión estable y persistente del gen durante periodos de tiempo superiores a un año. Estos datos, junto con las recientes observaciones de que la administración sistémica de un plásmido en grandes volúmenes de solución salina (sin el concurso de un vector) permite la transferencia de genes al hígado, con una eficacia que mejora en de varios ordenes de magnitud los procedimientos alcanzados hasta el momento, permite albergar fundadas esperanzas de que la mejora en el desarrollo de vectores, hará posible que estas eficacias puedan ser conseguidas en condiciones de administración más fisiológicas, compatible con los procedimientos clínicos. También se han desarrollado vectores dirigidos polivalentes, mediante la modificación química del vector con una molécula intermedia como la estreptavidina, lo cual permite incorporar moléculas biotiniladas (tales como anticuerpos) y por tanto dirigir el mismo vector hacia diferentes destinos en función del anticuerpo utilizado. La caracterización de los mismos demostra que: el complejo tiene capacidad para unir específicamente los anticuerpos en su superficie, lo cual permite la entrada selectiva en la célula y además son vectores que en función de su composición y tamaño presentan estabilidad en sangre durante periodos de tiempo prolongados. En nuestro caso, en estudios basados en su utilización en un modelo de leucemia humana en ratones scid con las células K562, confirmamos que los animales tratados con inmunoliposomas (dirigidos contra CD45) encapsulando oligonucleótidos antisentido contra el gen c-myb conduce a un aumento significativo de la supervivencia de los animales respecto a aquellos grupos tratados con inmunoliposomas encapsulando las secuencias sentido o el oligonucleótido antisentido administrado de forma libre.

Trabajo parcialmente financiado por IMTEFA/2000/41.

Conferencia 3.

ADVANCES IN THE GENE THERAPY OF HEMATOPOIETIC STEM CELL DISEASES

Juan A. Bueren.

Programa de Terapia Génica.CIEMAT/Fundación Marcelino Botín. Madrid.

Hematopoietic Stem Cells (HSCs) are very rare progenitor cells capable of long-term repopulation of myeloablated recipients. On the basis of the particular properties of these cells, one of the preferential procedures for the treatment of hematopietic congenic diseases relies on the genetic correction of the HSCs. The very inefficient transduction of human HSCs with vectors capable of stably inserting exogenous transgenes has, however, prevented for a long time the development of curative gene therapy protocols of the hematopoietic tissue. Nowadays, new tools and improved experimental procedures have been developed, greatly facilitating the transduction, as well as the expression of transgenes in a variety of tissues. Using immunodeficient NOD/SCID mice, we have been able to repopulate the hematopoietic tissues of these animals with retrovirally-transduced human cells which expressed the EGFP marker gene for long-periods of time. The sequential analysis of BM from these animals allowed us to investigate the dynamics of engraftment of human transduced cells and to determine the pattern of clonal repopulation in this in vivo model. The possibility of genetically correcting hematopoietic cells from patients suffering from potentially lethal hematopoietic diseases has been explored in Fanconi Anemia patients. The transduction of peripheral blood lymphocytes from FANC-A patients with retroviral vectors encoding the functional version of the FANC-A gene has shown an evident phenotypic correction of these cells. Both the survival and the chromosomal stability of these cells after mitomycin C and diepoxybutane exposures have been markedly improved in FANC-A-corrected versus uncorrected cells. Experiments with FANC-A knock-out mice and with NOD/SCID mice transplanted with human FANC-A-transduced CD34⁺ cells are now in progress to evaluate the efficacy of treating this disease with approaches based on the transfer of FANC genes into the HSCs.

Conferencia 4

REGENERATION OF ISCHEMIC CARDIAC MUSCLE AND VASCULAR ENDOTHELIUM BY ADULT STEM CELLS

Kathyjo A. Jackson^, Susan M. Majka^^&, Hongyu Wang, Jennifer Pocius, Craig J. Hartley, Mark W. Majesky⁺, Mark L. Entman*, Lloyd H. Michael*, Karen K. Hirschi^&, and Margaret A. Goodell

Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA.

In the past few years, it has been shown that stem cells from various tissues are capable of plasticity thereby giving rise to tissues of different origins from which the cells were isolated. In an article by Bittner et al, it was shown that cells from bone marrow were able to migrate and incorporate into cardiac tissue of mdx mice following bone marrow transplantation. Following cardiac injury, there is repair and remodeling of the cardiac tissue as well as blood vessels within the heart wall. In this study, we have attempted to identify and characterize the cells within the bone marrow which undergo differentiation to cardiac tissue.

We examined the role of hematopoietic stem cells purified as Hoescht 33342 low SP cells in cardiac and vascular regeneration following tissue injury. Hematopoietic stem cells were isolated from C57BL/6-Rosa mice and used in bone marrow transplants into lethally irradiated C57BL/6 mice. Following stable engraftment, occlusion of the left coronary artery was performed for 1 hour. Animals were allowed to recover for 2 or 4 weeks after which hearts were removed, frozen sectioned, and stained for Lac-Z, cardiac specific markers and endothelial markers. Hematopoietic stem cell derived cells were incorporated into cardiac muscle and endothelial cells. These data demonstrate a possible source of cardiac muscle precursors for use in future clinical settings.

Conferencia 5

DELIVERY OF THERAPEUTIC ANGIOGENIC GENES

Matthew L. Springer and Helen M. Blau.

Dept. of Molecular Pharmacology, Stanford University School of Medicine

This talk will focus on the delivery of genes encoding angiogenic factors with the aim of growing new blood vessels through ischemic tissue, that is, tissue that is deprived of blood and oxygen. The stimulation of angiogenesis provides a potential treatment for diseases ranging from ischemic heart disease to diabetes-induced vascular insufficiency in the limbs. Genes encoding factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) are being delivered in numerous animal models and clinical trials. In some approaches, delivery of the VEGF gene has resulted in moderate gene expression and has led to the growth of new blood vessels through ischemic skeletal and cardiac muscle in animals. These techniques are currently being tested by several investigators in clinical trials, and the results are quite promising. An additional approach being tested in animals, on which this talk will focus, involves the implantation of muscle precursor cells (myoblasts) that have been engineered in culture with retroviruses containing the VEGF gene, resulting in permanent high-level expression of the gene in these cells. The myoblasts are then injected into muscle, where they resume their role as muscle precursors and fuse directly into the pre-existing muscle fibers. The gene expression resulting from this system is extremely high and has resulted in hypervascularization of the muscle. Hemangiomas have resulted from injection of myoblasts expressing high levels of VEGF into skeletal and cardiac muscle, along with tangles of capillaries and possibly individual endothelial cells. The capillaries thus induced are connected to the rest of the circulation but are leaky. Subcutaneous or intraperitoneal implantation of encapsulated myoblasts has resulted in increased angiogenesis, inflammation, and vascular leakage. Large-caliber vessels that possess smooth muscle layers are found surrounding intramuscular implantation sites. Because these regions are frequently devoid of the capillaries that are usually present in muscle, it is possible that the capillaries in those regions were induced to enlarge and form a smooth muscle layer, suggestive of arteriogenesis. In regions of muscle into which fewer myoblasts have fused, non-pathological extra vessels are observed, still surrounded by the large-caliber smooth muscle-positive vessels. We have put the VEGF gene under the control of a tetracycline-regulatable promoter, with the aim of causing the gene to be expressed for a controlled period of time and then turned off after the desired physiological effect has occurred. These regulatable VEGF retroviruses are highly regulatable in cultured myoblasts, and efforts are underway to modify these vectors to work reliably in vivo.

Conferencia 6

CORRECCIÓN DEL SÍNDROME DE OBESIDAD Y DIABETES DE RATONES ob/ob MEDIANTE TRASPLANTE DE QUERATINOCITOS PRODUCTORES DE LEPTINA.

Marcela Del Rio, Fernando Serrano. JC. Segovia, Angel Ramirez, Alvaro Meana, José L. Abad, Manuel Gonzalez, Antonio Bernad, José L. Jorcano y Fernando Larcher.

Departamento de Biología Celular, Molecular y Terapia Génica. CIEMAT y Fundación Marcelino Botín para Terapia Génica. Madrid.

La deficiencia de leptina conduce a un sindrome de obesidad y resistencia a la insulina tanto en el ratón como en humanos. El ratón mutante obeso ob/ob, deficiente en leptina, constituye un excelente modelo donde ensayar sistemas correctivos mediante terapia génica somática sistémica. En este trabajo hemos corregido la deficiencia de leptina en el modelo ob/ob mediante trasplantes de queratinocitos manipulados genéticamente para producir leptina. En una primera aproximación, empleamos explantos de piel provenientes de ratones transgénicos hiperproductores de leptina que se trasplantaron a ratones ob/ob inmunodeficientes. Trasplantes menores al 10% de la superficie corporal fueron capaces de revertir completamente todos los síntomas del síndrome ob/ob. Los valores de peso corporal se normalizaron al cabo de un mes. El éxito en esta aproximación fue la base para el desarrollo de una terapia génica ex vivo empleando queratinocitos humanos primarios. Para ello se utilizó un vector retroviral bicistrónico codificando el cDNA de la leptina de ratón junto con el de la EGFP. Los queratinocitos infectados se seleccionaron mediante "sorting" de EGFP y se sembraron en nuestro sistema de cultivo organotípico. Se determinó la expresión de leptina in vitro y se trasplantaron los cultivos organotípicos a ratones ob/ob inmunosuprimidos mediante tratamiento con Ciclosporina-A. Tanto la glucemia como la ingesta cayeron a valores normales al cabo de 48 h con los trasplantes productores de leptina. El peso corporal disminuyó a lo largo de todo el experimento (16 días), alcanzándose reducciones de hasta el 30%. Nuestros resultados establecen, por una parte, una "prueba de principio" para la terapia génica cutánea sistémica y por otra, abren el camino para el desarrollo de un sistema terapéutico eficaz para el tratamiento dedeficiencias de leptina en humanos.

Conferencia 7

GENE THERAPY OF MONOGENIC DISEASES: HEMOPHILIA AS A MODEL

Gonzalo Hortelano, Ph.D.

Department of Pathology & Molecular Medicine
HSC Room 3N26 McMaster University Hamilton, Ontario L8N 3Z5 Canada

Hemophilia is a bleeding disorder caused by a deficient factors VIII (FVIII) or IX (FIX). Current treatment, based on regular life-long infusions of plasma-derived or recombinant factors is sub-optimal. An alternative treatment would be highly desirable. Gene therapy may be such alternative. A number of factors make hemophilia a particularly suitable disease to be treated by gene therapy. Firstly, the expression of FVIII and FIX are not tightly regulated. Supraphysiological levels of coagulation factors do not have apparent adverse effects. Secondly, even delivery of very small amounts of FIX can have a clinical benefit in severe hemophiliacs. In addition, even though the liver is the primary organ for the synthesis of FVIII and FIX, many cell types are capable of producing biologically active coagulation factors. Finally, there are excellent murine and canine models of hemophilia A and B that closely mimic the human condition, and can be used to explore gene therapy approaches to hemophilia. A number of different gene therapy protocols have been proposed. Most protocols have used viral vectors to deliver coagulation factors, often reaching physiological or at least therapeutic levels of coagulation factors in plasma of treated hemophilic animals. As a result of very encouraging pre-clinical data, several human trials are in progress. Very preliminary results from a human trial using the most promising vector to date, Adeno-Associated virus (AAV) are very encouraging. As an alternative approach to viral vectors, we are developing implantable microcapsules enclosing recombinant cells as a novel gene therapy delivery system. Recombinant cells, such as myoblasts, are engineered to secrete a therapeutic protein. To protect the allogeneic myoblasts from elimination in vivo, cells are enclosed in non-antigenic biocompatible alginate microcapsules prior to their implantation into the host. The use of this alternative gene therapy strategy for hemophilia B will be discussed.

Conferencia 8

CÁNCER: STRATEGIES TO ADAPT ADENOVIRUS FOR CANCER GENE THERAPY APPLICATIONS.

David Curiel. Director de la División de Terapia Génica, UAB, Alabama. USA.

We have endeavored targeting strategies to alter the tropism of adenovirus. We have currently defined four distinct methods to incorporate targeting ligands within the adenovirus capsid by genetic methods. These include insertions into the HI loop of the fiber knob, replacement of the fiber with fibritin chimeras, insertions into the hexon and additions to the p3/p9 capsid cement proteins. In each of these instances an infectious adenovirus genome has been constructed via homologous recombination and an infectious virus rescued. All of the methods have allowed intact particles to be derived thus feasibilizing our goal of in vivo analysis of altered vector tropism.

To achieve integration of the UCLA imaging approaches, we have engineered vector expression cassettes to allow expression of more than one transgene. In this way we hope to be able to deliver both therapeutic genes as well as imaging genes. To this end, a dual expression cassette was designed where transgenes could be expressed via a CMV promoter in addition to a second CMV promoter for deriving expression of imaging gene cassettes. This expression system has been configured into a plasmid-based Ad vector packaging system to allow rapid and facile constructing of tropism-modified vectors compatible with our goal of imaging analysis.

Conferencia 9

DNA AND GENE-BASED VACCINES

Margaret A. Liu

Senior Advisor in Vaccinology, Bill & Melinda Gates Foundation and Vice-Chairman, TRANSGENE.

Delivery of genes encoding antigens has become a major focus of efforts to develop vaccines for prophylaxis and treatment of infectious diseases as well as for therapy of cancer. The rationale behind this application of gene therapy as been to deliver antigens into the cellular locations best suited for the induction of the desired immune responses, whether antibodies or cellular responses or both. Much of the impetus for this approach to vaccines arose out of the recent understanding that in general in order to induce a cytolytic T lymphocyte (CTL) response against a tumor or virally-infected cell, an antigen needed to be present in the cytoplasm of the antigen presenting cell in order to be appropriately processed into the peptide epitopes that then bind to newly synthesized MHC Class I molecules for presentation to T cells on the surface of the antigen presenting cell (APC). Thus by delivering a gene encoding the antigen to the APC, rather than an exogenous protein, which would generally not have access to the cytoplasm, the transfected APC endogenously synthesizes the antigen, that then can be appropriately processed and presented. The demonstration of the ability of DNA vaccines (plasmid DNA encoding an antigen) to generate CTLs and provide protective immunity has led to the development of second generation approaches to enhance the potency of plasmid DNA. Such vaccines can also deliver the genes for antigens that induce antibody responses.

Viral vectors encoding heterologous antigens are likewise being used to deliver the genes of interest to cells. These vectors capitalize upon both the efficacy of the viral vectors to infect cells and deliver the gene of interest and also upon the immune stimulating effects of the viral vector itself.

This talk with give an overview of various DNA and gene delivery approaches for the induction of protective immune responses, with an emphasis on second-generation DNA vaccine delivery approaches and viral vectors such as alpha viruses and vaccinia.

COMUNICACIONES

Comunicación 1

VECTORES RETROVIRALES PARA TERAPIA GÉNICA DE SUSTITUCIÓN.

Humberto Sánchez, Laura Fuentes y Antonio Talavera.

Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" CSIC-UAM. Cantoblanco 28049-Madrid.

El uso de vectores retrovirales para terapia génica de sustitución requiere la eliminación del proceso integrativo del virus de manera que la secuencia de DNA transportada a la célula quede disponible para su intercambio con su secuencia homóloga en el genoma celular. Con este objetivo se han desarrollado vectores retrovirales delecionados en el sitio reconocido por la integrasa viral. Este tipo de vectores defectivos en integración y portadores de secuencias internas del gen de la timidina quinasa del virus herpes (gen htk) fueron utilizados para transducir células de ratón que contenían un gen htk no funcional debido a una inserción de 4 pares de bases. La corrección del gen residente defectivo mediante recombinación homóloga fue estudiada mediante selección de las células transducidas en medio HAT. El DNA genómico de los clones seleccionados fue sometido a análisis de restricción e hibridado con una sonda radiactiva homóloga al gen htk. La frecuencia de recombinación homóloga obtenida varió entre 1 y 3 clones corregidos por cada 10.000 células transducidas. Esta frecuencia es 2 órdenes de magnitud mayor que la obtenida mediante el uso de DNA desnudo. El análisis molecular de todos los clones resistentes en medio HAT estudiados mostró el patrón de restricción e hibridación esperado y exclusivo de los clones con el gen htk corregido.

Con el objeto de facilitar el reconocimiento y análisis de los clones corregidos hemos desarrollado un modelo celular mejorado en el que el gen htk se ha fusionado al gen egfp.Un gen de resistencia a higromicina, cuya traducción queda controlada por un sitio de entrada ribosomal interno (IRES), fue incluido en la construcción, para asegurar que el gen de fusión defectivo se expresaba en las células seleccionadas y por lo tanto podía ser objeto de corrección molecular. Dicha corrección debe reestablecer la fase de lectura de la proteína de fusión, haciendo posible la identificación de células en las que ha tenido lugar un doble suceso de recombinación homóloga, proceso inherente a una auténtica sustitución génica.

Comunicación 2

TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIANTE VECTORES VIRALES PARA DIRIGIR LA EXPRESION DE GENES EXOGENOS A ISLOTES PANCREATICOS IN VIVO.

M. Chillón, E. Ayuso, F. Garcia1, P. Otaegui, E. Riu, B. Juanola², F. Bosch

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria; Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG), 1Departamento de Medicina y Cirugía Animales, 2Hospital Clínico Veterinario; Universitat Autònoma de Barcelona.

La diabetes tipo 1 es el resultado de la destrucción autoinmune de las células ß del páncreas. Las aproximaciones para una terapia curativa real de la diabetes tipo 1 deberían de estar centradas en la regeneración del páncreas endocrino. En la actualidad la manipulacion genética in vivo del páncreas aún no ha sido descrita con éxito. Sin embargo, en nuestro laboratorio hemos desarrollado con éxito un sistema que permite la infección in vivo del páncreas por vectores virales. El primer paso fue analizar cual de los vectores virales disponibles (Ad, AAV y LV) presentaba un tropismo positivo para las células ß in vivo. Todos los vectores virales utilizados contienen el gen ß-galactosidasa bajo la acción del promotor CMV. Cada uno de los vectores virales fueron inyectados en la arteria pancreático-duodenal de perro. No se ha observado pancreatitis, ni alteración en los niveles de enzimas hepáticos, ni ningún síntoma de respuesta inmune en las diferentes dosis utilizadas. Después de la eutanasia de los animales, se analizaron muestras de páncreas, así como de hígado y bazo para estudiar la distribución de los vectores virales por otros órganos. También se cuantificó el nivel de expresión del transgen por luminometría y se analizaron los tipos celulares infectados por cada vector. Los resultados confirman que los adenovirus son capaces de infectar principalmente células ß. Esta especificidad de tropismo, posiblemente a través del receptor CAR, coincide con la especificidad observada en humanos y ratones mediante experimentos in vitro de islotes de Langerhans cultivados. Estos resultados muestran por primera vez, que es posible transferir genes exógenos de manera específica a las células ß de islotes de Langerhans, lo

que permitirá una terapia más precisa para la diabetes tipo 1.

Proyecto financiado por la CICYT SAF 99-0094 y por la Fundación de la Maratón de TV3.

Comunicación 3

DESARROLLO DE UN NUEVO VECTOR RETROVIRAL SUICIDA PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED EN TRASPLANTE ALOGENICO DE MEDULA OSEA.

José C. Segovia, Llanos Casanova, María L. Lamana, Israel Orman, Katrin Ehlert, José L. Jorcano y Juan A. Bueren.

Programa de Terapia Génica. CIEMAT/ Fundación M. Botín. Madrid.

La existencia de vectores retrovirales codificando proteínas marcadoras no-inmunogénicas constituye una herramienta muy útil para el desarrollo de protocolos clínicos de marcado y terapia génica. Con el objetivo de marcar células hemtopoyéticas humanas, y más específicamene linfocitos T, hemos desarrollado un nuevo vector retroviral codificando una versión truncada del receptor de crecimiento epidérmico (DEGFR). Estudios de citometría de flujo mostraron que ni células Jurkat, ni linfocitos T de sangre periférica expresan EGFR endógeno. Aunque DEGFR está truncado en su región intracelular y no puede transducir señales, podría inducir señalización mediante heterodimerización con otros miembros de la familia del EGFR, en particular con HER2, HER3 y HER4. Ensayos de Northern-blot, Western-blot e inmunoprecipitación demostraron que ninguno de estos receptores se expresa en células T. Basándonos en estas observaciones, se construyó un vector retroviral expresando DEGFR bajo el control del promotor de SV40 y el gen suicida citosina deaminasa (CD) - que induce susceptibilidad a la prodroga 5-fluorocitosina (5-FC) - bajo el control del promotor del LTR viral (vector DLCSE). En comparación a muestras falsamente infectadas, células T humanas infectadas con DLCSE fueron fácilmente detectadas mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para el dominio extracelular de EGFR. Células expresando DEGFR se mostraron susceptibles a 5-FC en estudios de viabilidad celular a lo largo del tiempo. Estudios de unión de anexina V mostraron un alto porcentaje de inducción de apoptosis en las células transducidas y cultivadas en presencia de 5-FC. En resumen, los resultados presentados sugieren que el gen DEGFR es un marcador alternativo a los utilizados hasta el momento en protocolos de terapia génica de células hematopoyéticas humanas, y en particular de linfocitos T humanos. Asimismo, se muestra que el vector DLCSE es un susceptible de ser utilizado para terapias suicidas como las dirigidas al control de la enfermedad injerto contra huésped en trasplante alogénico de médula ósea.

Comunicación 4

Identificación de distintas clases de células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas por su capacidad proliferativa y de automantenimiento

Guillermo Guenechea^1,2, Olga I. Gan¹, Craig Dorrell¹, John E. Dick¹

¹Programs in Cancer/Blood Research and Gene Therapy, Hospital for Sick Children and Department of Molecular and Medical Genetics, University of Toronto.Toronto. Canada,

²Gene Therapy Program, CIEMAT/Fundación Marcelino Botín, Madrid.

Debido a la ausencia de herramientas experimentales para la caracterización del programa de desarrollo de células madre hematopoyéticas humanas se conoce poco sobre la composición del compartimento de células madre. En este estudio, utilizando ratones inmunodeficientes (NOD/SCID) trasplantados con progenitores transducidos de sangre de cordón (denominados células repobladoras de ratones SCID, SRC), demostramos que las células madre hematopoyéticas humanas se distinguen por su capacidad de repoblación y su potencial de automantenimiento. Los análisis de clones de células madre se basaron en la identificación de sitios únicos de integración del vector retroviral en aspirados seriados de médula ósea. Estos análisis mostraron que la reconstitución de los animales era generalmente oligoclonal, con una gran variabilidad en la vida media y capacidad proliferativa de SRCs individuales. La mayoría de los clones contribuía al injerto humano durante varias semanas después del trasplante y desaparecían a lo largo del tiempo, mientras que otros aparecían más tarde y persistían durante el periodo de análisis. Otra evidencia de la heterogeneidad de células madre se encontró en su capacidad para reconstituir receptores secundarios. Estos resultados evidencian la existencia de diferentes clases de células madre humanas con distintos potenciales de automantenimiento y distintas capacidades de repoblación a corto y largo plazo.

Comunicación 5

TRANSFERENCIA SELECTIVA DE GENES CON UN VECTOR NO VIRAL DIRIGIDO DE BASE POLIMÉRICA EN UN MODELO DE LINFOMA HUMANO.

Vicent M Guillem^1,2,Mar Tormo² , Fernando Revert¹, Isabel Benet², Marta Benet¹, Francisco Dasí¹, Inés Moret¹, Antonio Crespo¹, Javier García-Conde², Salvador F Aliño¹.

¹Grup de Teràpia Gènica. Dpt. de Farmacologia. Facultat de Medicina. Universitat de València. València.

²Servei d Hematologia i Oncologia. Hospital Clínic Universitari. Facultat de Medicina. Universitat de València. València.

La entrega selectiva y eficiente de ácidos nucleicos terapéuticos a las células es un objetivo prioritario en la terapia génica no viral. Los poliplejos (complejos ácido nucleico polímero catiónico) basados en polietilenimina (PEI) han sido descritos como buenos agentes de transfection. Sin embargo, la entrega del ácido nucleico mediada por poliplejos en particular, y por otros agentes de transfección no dirigidos en general se produce a través de un mecanismo inespecífico y es poco eficaz en la en la transfección de algunos tipos celulares, como es el caso de las células de origen hematopoyético. En la presente comunicación se recoge la aplicación del inmunopoliplejo, un vector no viral dirigido basado en un poliplejo, a la transferencia de genes in vitro en un modelo celular hematopoyético derivado de linfoma humano. El diseño del vector está basado en la unión covalente al PEI de una proteína puente (Streptavidina) , cuya función es la de actuar como punto de anclaje al esqueleto polipléjico de proteínas biotiniladas direccionadoras, las cuales deben reconocer un elemento específico de la membrana de la célula diana y promover la entrada del ácido nucleico a la célula. Este diseño permite un fácil recambio del elemento direccionador (generalmente un anticuerpo biotinilado) sin necesidad de alterar el esqueleto Streptavidin-poliplejo, lo cual confiere al vector gran versatilidad MÉTODOS: La eficacia de transfección dirigida del inmunopoliplejo fue estudiada in vitro utilizando el gen de la proteína fluorescente verde (EGFP) como marcador y el anticuerpo anti-CD3 como elemento direccionador en el transfección de una línea CD3 positiva (Jurkat). Se utilizó como línea celular control una línea celular mutante derivada Jurkat (J.RT3-T3.5). que es CD3-negativa. . La actividad de transfección se evaluó mediante la cuantificación de la fluorescencia media por célula y el porcentaje de células positivas a través de citometría de flujo RESULTADOS: Los resultados mostraron niveles de fluorescencia media por célula 16 veces mayores en las células CD3-positivas que en las CD3-negativas, indicando que la actividad del transfection del immunopoliplejo en este modelo es esencialmente específica. Varios agentes de transfección inespecíficos y un inmunopoliplejo que incorporaba como elemento direccionador un anticuerpo irrelevante (antiCD19) mostraron pobre o nula actividad de transfeccion. CONCLUSIÓN: Se concluye que el immunopoliplejo es un buen vector no viral para la entrega específica y selectiva de genes para la terapia génica del sistema hematopoyético.

Proyecto financiado por el F.I.S.(Nº 98/0716).

Comunicación 6

FRAGMENTO C DE LA TOXINA TETÁNICA: UN NUEVO VECTOR PARA LA TERAPIA GENICA DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS.

Miana-Mena, J.; Muñoz, M.J. ; Ciriza, J. , Martin-Burriel, I. , Rodellar, C; Zaragoza, P. ,Brûlet, P. y Osta, R.

Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos. Universidad de Zaragoza. ZARAGOZA.

De forma natural, la toxina tetánica tras su introducción en el músculo es capaz de alcanzar las motoneuronas y realizar un transporte retrogrado intraneuronal y transináptico a lo largo del Sistema Nervioso Central gracias a la presencia de la parte C terminal de su cadena pesada. Dicha parte C terminal es conocida con el nombre de TTC o fragmento C de la toxina tetánica y presenta tres características que le hacen ser un buen candidato para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, por una parte guarda la capacidad del transporte neuronal similar a la toxina nativa, por otra no presenta poder patógeno y además es capaz de transportar actividades enzimáticas.

En el presente trabajo hemos realizado la inyección intramuscular de un plásmido que contiene la fusión de la enzima B-galactosidasa y el fragmento C de la toxina tetánica bajo un promotor eucariota (CMV-LacZTTC) con el fin de comprobar si:

I) ¿Tras la inyección de DNA desnudo del plásmido CMV-LacZTTC se observaba su expresión en la células musculares?.

II) ¿ La proteína de fusión producida por dichas células era capaz de salir de la fibra muscular y alcanzar la placas neuromusculares de la motoneuronas?

III) ¿ Una vez dentro de los axones de dichas células conservaba su transporte retrógrado?
IV) ¿ Conservaba tambien la característica de realizar un transporte transináptico?.

Para responder a estas preguntas se estudiaron 80 ratas tras la inyección del DNA desnudo mediante inyección intralingual. El estudio de la posible migración al Sistema Nervioso Central se estudio mediante el Sistema Hipoglosal, tanto en los animales inyectados con la proteína de fusión (LacZ-TTC) como en los controles (B-galactosidasa).
Los resultados obtenidos nos han permitido demostrar que la proteína de fusion LacZ-TTC tras ser producida por las células musculares, es capaz de salir de ellas, introducirse en los axones de las motoneuronas y alcanzar mediante transporte retrógrado y transináptico las motoneuronas de Centros superiores. Los controles no mostraron actividad en el Sistema Nervioso. Estos resultados hacen a este vector un posible candidato para su utilización como vectore en enfermedades neurodegenerativas, más especificamente las enfermedades que afectan a las motoneuronas.

Comunicación 7

EFFICIENT GENE DELIVERY BY IMPROVED TRANSFERRIN-LIPOPLEXES

C. Tros de Ilarduya ^a, M.A. Arangoa^a and N. Düzgünes ^b

^a Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, School of Pharmacy, University of Navarra, 31080 Pamplona

^b Department of Microbiology, School of Dentistry, University of the Pacific, San Francisco, CA 94115, USA

Most of the gene therapy strategies to-date rely upon recombinant viral vectors to mediate gene transfer, e.g. retroviruses, adenoviruses, herpes viruses and adeno-associated virus. Although these vectors have been and/or will be employed successfully, many laboratories are now investigating non-viral methods of introducing genes efficiently into mammalian cells. The advantages of these non-viral systems are their relative simplicity, greater flexibility in the size and sequence of DNA molecules that can be delivered, and increased safety. Gene transfer of DNA with non-viral vectors into specific tissues in vivo has been disappointing due largely to its low level of efficiency and relatively short duration of expression of the transgene. Receptor-mediated gene transfer has considerable potential for use in human gene therapy if perfected to a point where it is both a reliable and efficient vehicle for gene delivery into differentiated non-dividing cells. In previous work we have shown high transfection efficiency into dividing cells by using Tf (transferrin)-lipoplexes even in the presence of high concentration of serum. Here we present a highly efficient and reliable protocol for gene delivery to non-proliferating primary cultured rat hepatocytes and adipocytes in the presence of 60% serum, using DOTAP/DOPE-pCMVLuc lipoplexes associated with transferrin (Tf), an iron-transporting serum glycoprotein. The association of Tf with cationic liposomes increased luciferase expression compared to plain lipoplexes in primary culture rat hepatocytes and adipocytes, as well as in HepG2 and 3T3-L1 cells. Transfection activity increased with increasing charge ratio (+/-) of lipid to DNA in the complexes. No measurable luciferase expression was observed with the naked plasmid. In vivo data showed that the level of gene expression is increased specially in the lung. Our laboratory is also currently studying different methods to improve transfection by Tf-lipoplexes by pre-condensing DNA with various agents. In this presentation we will discuss the role of protamine on the transfection efficiency as well as the critical steps in the preparation of the DNA-ligand complexes. Promising results for in vivo application will be presented.

Comunicación 8

DESARROLLO DE VECTORES SV40 RECOMBINANTES PARA SU USO EN TERAPIA GENICA

M. Vera, P. Berreondo, I. Melero, J. Ruiz, J. Prieto y P. Fortes

Dpto. Medicina Interna. Universidad de Navarra. Pamplona.

SV40 es un papovavirus cuyo genoma circular de doble hebra de DNA puede dividirse en una zona de expresión temprana y otra de expresión tardía. Los genes de expresión temprana son el Ag-T y Ag-t, implicados tanto en la replicación del virus como en la transcripción de los genes tardíos, que son las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3.
SV40 presenta muchas ventajas para su aplicación en terapia génica: (i) un amplio tropismo a nivel de especie y tipo celular, infecta tanto células en división como en reposo, (ii) puede obtenerse en alta concentración, (iii) la expresión de los transgenes es prolongada y (iv) no es inmunogénico.

En el laboratorio, hemos comenzado el desarrollo de virus SV40 recombinantes para su uso en terapia génica. Para ello, hemos reemplazado las secuencias de Ag-T por genes reporteros o terapéuticos. Estas construcciones pueden ser amplificadas en células COS-1 que administran el Ag-T en trans.

Los construidos realizados son:

- Introducción de un sitio de clonaje múltiple inmediatamente después del promotor temprano, que facilita el clonaje de diferentes transgenes.

- Clonaje del gen de la luciferasa para realizar estudios in vitro e in vivo sobre el comportamiento del virus recombinante.

- Clonaje del gen de la IL-12 de la marmota para el tratamiento de la hepatitis viral de tipo B.
- Clonaje del gen del IGF-1 de rata para el tratamiento de la cirrosis.

- Clonaje del gen de la IL-15 murina para el tratamiento de tumores mediante inmunoterapia

Comunicación 9

TRANSDUCCIÓN DE CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO MEDIANTE VECTORES LENTIVIRALES

Francisco Martin, Stuart Neil, Yasuhiro Ikeda and Mary Collins

University College London . London

Las células de la línea monocítica son susceptibles de infección por VIH-1 tanto in vitro como durante infección en pacientes. En el presente trabajo se estudia la capacidad de los vectores basados en VIH-1 para infectar monocitos humanos, macrófagos derivados de Monocitos (MDM) y células dendríticas con la intención de desarrollar un protocolo eficiente para expresar antígenos en dichas células. Monocitos incubados con el vector el mismo día de aislamiento son resistentes a infección por vectores derivados de VIH, transducción de dichas células solo es detectable después de madurar a macrófagos (5-7 días en cultivo). Esta transducción dependiente de maduración monocito-macrófago es independiente de la presencia de las proteínas accesorias Vif,Vpr,Vpu y Nef en las células empaquetadoras. VIH nef-env- pro virus psedotipado con VSV-G se comportan de la misma manera indicando que la restricción observada no es debido a la ausencia de elementos en el vector que estando presentes en el virus se requieran para infectar dichas células. Los niveles y extensión de transcripción en reverso son similares en monocitos o macrófagos. Esto indica la capacidad de los vectores de entrar en las células utilizando una ruta que no dificulta la capacidad del vector de terminar la transcripción en reverso. Sin embargo la presencia de círculos 2LTR no pudo detectarse, sugiriendo un bloqueo de la infección al nivel de la entrada al núcleo. La infección de monocitos recién aislados pudo ser rescatada mediante incubación con medio utilizado para diferenciación de monocitos a células dendríticas. Estos resultados sugieren un método mejorado para la transducción de estos tipos celulares.

Comunicación 10

ASIALOFETUIN-LIPOPLEXES FOR ENHANCED TRANSFECTION OF HEPATIC CELLS

M.A. Arangoa ^a, N. Düzgünes ^b and C. Tros de Ilarduya ^a

^a Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, School of Pharmacy, University of Navarra. Pamplona.

^b Department of Microbiology, School of Dentistry, University of the Pacific, San Francisco, CA 94115, USA

Hepatocytes present on their surface the asialoglycoprotein receptor, which recognises a broad range of molecules, including asialofetuin (AF), possessing terminal galactose and N-acetylgalactosamine residues. Although it is known that AF covalently bound to cationic liposomes enhances transfection, we have developed a simplified protocol for preparing targeted lipid-DNA complexes (lipoplexes), by first associating the ligand with cationic liposomes. The lipoplexes were composed of DOTAP/CHOL/pCMVluc (VR1216) at 4/1(+/-) lipid/DNA charge ratio.The physico-chemical characterisation of AF-lipoplexes indicated a size close to 200 nm, and a variable surface charge as a function of the amount of associated AF. In HepG2 cells, 1 μg of AF adsorbed to lipoplexes, containing 1 μg DNA and 13 μg of lipid, led to a significant increase in transfection, compared to plain lipoplexes. In contrast, much larger amounts of AF (in the range of 18 to 36 μg) resulted in lower transfection than complexes without AF; these AF-lipoplexes had a net negative surface charge, which could explain at least partially the decrease in transfection activity. At an intermediate quantity of complexed AF (around 9 μg), transfection was higher than plain lipoplexes, although the AF-lipoplexes displayed a net negative charge. This characteristic can be useful in avoiding the potentially adverse interactions of positively charged lipoplexes with negatively charged macromolecules in the blood after in vivo administration.

The specificity of AF-lipoplexes was studied by the addition of an excess of AF before and during transfection. Under these conditions, transfection by AF-lipoplexes was dramatically reduced. Transfection activity was also measured in receptor-defective cells, such as HeLa. In this case, both plain and AF-lipoplexes resulted in similar levels of transgene expression, supporting the hypothesis that transfection by AF-lipoplexes is mediated by the asialoglycoprotein receptor.

In preliminary studies in Balb/c female mice injected intravenously, an increase in transfection in the lung and liver was observed with AF-lipoplexes. The higher transfection activity in the lung may be due to trapping of the complexes because of their relatively large size. In the liver, enhanced transfection may be a consequence of the specific recognition of the AF-lipoplexes by hepatocytes or Kupffer cells, which possess receptors with specificity for terminal galactose.

Comunicación 11

CHARACTERIZATION OF NONVIRAL DNA COMPLEXES.

Inés Moret^{1, 2}, Jose Esteban Peris², Vicent M. Guillem¹, Marta Benet¹, Antonio Crespo¹ and Salvador F. Aliño¹.

¹Dpt. Farmacologia. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia.

²Dpt. Farmacia y Tecn. Farmac. Facultad de Farmacia. Universidad de Valencia.

Gene therapy based on nonviral vectors requires a deep assessment of different factors in relation with the complexes that are employed. Our work has been focused on the way to quantify the amount of DNA added to complexes (with PEI and DOTAP) and the stability against degradation by either from DNase or serums.

Effect of glycosaminoglycans: heparan sulphate was tested at different percentage against PEI or DOTAP complexes in a fluorimetric and electrophoretic way using fluorescent probes. The stability against degradation was tested facing the complexes against solutions of DNase or serum, incubating them and taking samples at different periods of time. Then quantifications and electrophoric studies were made. Also morphological studies by electron microscopy of the complexes are reported.

As results, when heparin was added similar fluorescent intensity was obtained with naked DNA and PEI/DNA complex, which can be interpreted as a complete release of DNA from the complex. Similarly, DNA was also released from DNA/DOTAP complex by heparin. Another observation is that complexation of DNA with PEI and DOTAP apparently protected DNA from Dnase and serum degradation. The presence of serum doesnt seem to affect the stability of the DNA which belongs to the complexes when they are incubated in serum.

This study reflects that the employ of glycosaminoglycans is useful to determine the DNA which belongs to the complexes (PEI or DOTAP), and the stability of these complexes against degradation indicates that the protection is good enough to assure the integrity of the DNA material.

Supported by IMTEFA/2000/41grant.

Comunicación 12

INFLUENCE OF MYELOABLATION, GRAFT SIZE, AND EX VIVO MANIPULATION ON THE ENGRAFTMENT OF TRANSDUCED MURINE HEMATOPOIETIC CELLS

Puig T, Kádár E, Limón A, Cancelas JA, García M, Eixarch H, Luquín L, Barquinero J.

Institut de Recerca Oncologica .Barcelona.

To investigate to which extent myeloablation influences the engraftment of retrovirally transduced hematopoietic cells, groups of five C57BL/6J (CD45.2) mice receiving different doses of total body irradiation (TBI) (dose range: 1 - 9 Gy) or no myeloablation were transplanted with either 0,5 x 106 or 5 x 106 of transduced bone marrow (BM) cells, or 0,5 x 106 non manipulated BM cells from 5-fluorouracil (5-FU) treated B6/SJL (CD45.1) donor mice. Short (40 days) and long-term (4 months) engraftment and transduction efficiency were analyzed in the recipient mice. No donor cells were observed in the peripheral blood (PB), the spleen, or the BM of non-myeloablated mice, whereas TBI allowed both short and long-term engraftment in a dose dependent manner. Similar percentages of cells expressing the transgene were found in all groups of transplanted mice regardless of the dose of TBI received and the level of engraftment achieved, suggesting that in this experimental model immune responses to cells expressing the transgene do not influence the fate of the transduced graft. In addition, the relative maintenance of the percentages of transgene expressing cells in vivo up to four months indicates that transduced cells have a similar long-term repopulating ability than non-transduced cells. Transplantation of a higher dose of transduced cells (5 x 10⁶) or 0,5 x 10⁶ fresh non-manipulated cells yielded significantly higher levels of engraftment than transplantation of 0,5 x 10⁶ transduced cells in all groups of recipient mice, regardless of the dose of TBI received. These results indicate than myeloablation facilitates the engraftment of transduced cells in a dose-dependent manner, that mice engrafted with EGFP+ HSCs probably develop immune tolerance to cells expressing the transgene, and that increasing the size of the graft and reducing the cell manipulation required to transduce hematopoietic stem cells (HSCs) may be beneficial for successful gene and cell therapies involving the hematopoietic system.

Comunicación 17

NIVELES TERAPÉUTICOS DE FACTOR VIII (FVIII) HUMANO EN RATONES IMPLANTADOS CON CÉLULAS RECOMBINANTES ENCAPSULADAS

Carmen García-Martín^1,3, Marinee K L Chuah⁴, Dominique Gallardo³, Frederick A Ofosu^1,2, Thierry VandenDriessche⁴, Gonzalo Hortelano^1,2.

¹Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada; ²Canadian Blood Services; ³Unitat de Recerca, Centre de Transfusió i Banc de Teixits, Barcelona; ⁴Center for Transgene Technology and Gene Therapy, Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, University of Leuven, Leuven, Belgium.

La utilización de microcápsulas conteniendo células recombinantes productoras de proteínas terapéuticas constituye una posible alternativa a las estrategias de terapia génica actuales. Las microcápsulas son esferas de unos 300-400 mm de diámetro constituidas por alginato, un polisacárido biocompatible no antigénico. Una vez implantadas en ratones, pueden mantener la viabilidad de las células en su interior durante periodos prolongados de tiempo. Esto es posible gracias a una permeabilidad selectiva que hace posible la entrada de nutrientes y la eliminación de las sustancias de desecho, protegiendo a las células alogénicas de la respuesta inmune por parte del huésped una vez implantadas intraperitonealmente. El objeto de este estudio consiste en la generación de microcápsulas capaces de sintetizar altos niveles de FVIII humano, proteína de coagulación de cuya actividad carecen los afectos de hemofilia A. Para ello se transdujeron mioblastos murinos (C2C12) y células epiteliales de riñón canino (MDCK) con el vector MFG conteniendo el cDNA del FVIII humano con el dominio B deleccionado (hFVIII-BDD). Anteriormente ya habíamos evidenciado que mioblastos encapsulados pueden producir niveles terapéuticos de factor IX in ratones (Blood 87:5095, 1996; Hum. Gene Ther. 8:1221, 1999). Mioblastos modificados secretaban in vitro ~1mg de FVIII/10⁶ células/día, mientras que las células MDCK producían unos 800 ng de FVIII/10⁶ células/día. Estos clones fueron encapsulados y analizados in vitro, observándose una activa secreción de hFVIII-BDD (Mr ~200 kDa) en el medio de cultivo. Tras estos resultados procedimos a evaluar el suministro de FVIII in vivo. Un total de 5x10⁶ células recombinantes (C2C12 ó MDCK) fueron encapsuladas e implantadas intraperitonealmente en ratones inmunocompetentes (C57BL/6) e inmunodeficientes (SCID), detectándose hFVIII-BDD en todos los ratones implantados. Ratones C57BL/6 implantados con mioblastos C2C12 llegaron a tener niveles de FVIII de hasta 22 ng/ml mientras que los implantados con células MDCK tuvieron un nivel más modesto de 7 ng/ml, si bien en ambos casos los niveles fueron terapéuticos (>2 ng/ml). Al cabo de una semana los ratones C57BL/6 presentaban niveles de FVIII indetectables mientras que se observaban crecientes niveles de anticuerpos anti-hFVIII. En los ratones SCID el patrón de secreción de FVIII fue similar al de los ratones normales. Microcápsulas recuperadas los días 2 y 7 post-implante de ratones C57BL/6 evidenciaron una buena viabilidad celular (~70%) pero la secreción de FVIII se había reducido 3 veces respecto a los niveles pre-implante. Asimismo, mediante la técnica de PCR cuantitativa observamos una reducción de la producción de mRNA FVIII in vivo. En resumen, hemos obtenido niveles terapéuticos de FVIII humano circulante en ratones mediante el uso de microcápsulas, si bien dichos niveles no son sostenidos, evidenciando una inactivación del vector MFG in vivo.

Comunicación 18

GENE CFTR TRANSFER AND PERSISTENCE OF EXPRESSION OVER TIME

Marta Benet, Fernando Revert, Francisco Dasí, Ester Escrig, Vivente Guillem, Inés Moret, Antonio Crespo, Salvador F. Aliño.

Dpto. Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia.

The success of gene therapy depends on the efficacy of a vector in delivering a gene to the cell, and on the persistence of gene expression over time. In the present work we used lipoplexes (cationic lipid-DNA complexes) and polyplexes (cationic polymer-DNA complexes) as nonviral vectors to transfer CFTR gene. The ability of these vectors to transfect cells and restore CFTR functional activity was evaluated by SPQ, MQAE and DISBAC assays. Here we report a comparative assay of gene CFTR transfer and persistence of expression over time, following in vivo mouse respiratory tract gene transfer. We compared the efficacy of gene transfer instillation directly to the mouse trachea (4 μg DNA/mouse) as a single dose versus distribution in 4 doses over 1 hour. At 48 hours post-administration, gene expression in lung was higher when DNA was administered in the fractionated dose mode. In time-persistence studies, human CFTR gene expression was detected by RT-PCR in lung 14 days after administration using polyplexes; in comparison, expression persisted only 48 hours with lipoplexes. To avoid surgical and traumatic procedures, we conducted a dose-dependence study of CFTR gene transfer by nasal instillation and observed that 8 μg DNA/mouse mediated similar expression efficiency as 4 μg DNA/mouse via intratracheal instillation. In multiple dose treatment, gene expression persisted 45 days after administration with both lipoplexes and polyplexes. We conclude that nasal instillation is a good procedure that offers advantages as treatment involving a repeat dosing regimen to secure long-term gene expression.

Supported by CICYT grants SAF99-0109.

Comunicación 19

EXPRESIÓN DE INSULINA POR EL MÚSCULO ESQUELÉTICO MEDIANTE VECTORES ADENOASOCIADOS (AAV) Y ELECTROTRANSFERENCIA IN VIVO.

A. Mas, M. Chillón, J. Montané, E. Riu, P. Otaegui y F. Bosch.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Universidad Autónoma de Barcelona.

La diabetes mellitus de tipo 1 se caracteriza por una hiperglucemia en ayunas causada por la ausencia de insulina. El tratamiento con una terapia intensiva de insulina ha demostrado que una insulinemia basal da lugar a un retraso en la aparición de las complicaciones asociadas, pero no impide la aparición de episodios hipoglucémicos. Por tanto, son necesarios nuevos métodos más eficientes para conseguir unos niveles de insulina en sangre más constantes y homogéneos durante largos períodos de tiempo. Actualmente el músculo esquelético es utilizado como tejido diana para la producción de niveles terapéuticos de proteínas. Los sistemas más eficientes de transferencia de genes in vivo a músculo son los virus adenoasociados (AAV) y la electrotransferencia de DNA, ya que proporcionan una elevada eficiencia de transferencia aumentando la estabilidad y tiempo de expresión del transgén. Mediante electrotransferencia o AAV se han obtenido ratones que expresan de manera constitutiva en el músculo esquelético el gen de la insulina humana. Con el objetivo de estudiar si la expresión de la insulina era suficiente para obtener un mayor control de la glucemia, ratones control y que expresaban insulina fueron sometidos a un tratamiento de múltiples dosis con estreptozotocina. Se observó que, a diferencia de los ratones control, los ratones que expresaban el gen de la insulina presentaban unos niveles de glucosa en sangre inferiores tanto en alimentación como en ayunas. Estos resultados muestran que la expresión de insulina por el músculo esquelético puede ser una nueva aproximación de terapia génica para el tratamiento de la diabetes de tipo1.
Trabajo financiado por: CICYT (SAF 99-0094), Fundació La Marató TV3, FEDER (2FD97 - 1984)

Comunicación 20

NORMALIZACIÓN DE LA GLUCEMIA EN RATONES DIABÉTICOS TRAS TRANSPLANTE DE CÉLULAS MUSCULARES QUE EXPRESAN GLUCOQUINASA.

M. Ontiveros, P. J. Otaegui, T. Ferre, E. Riu, R. Jiménez y F. Bosch.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica. Universidad Autónoma de Barcelona.

La hiperglucemia crónica es la responsable de las complicaciones secundarias específicas de la diabetes tipo 1. La terapia intensiva con insulina retrasa la aparición y enlentece la progresión de estas complicaciones. Sin embargo, esta terapia aumenta el riesgo de episodios de hipoglucemia. Se ha observado que la hiperglucemia también puede disminuirse sobreexpresando en hígado o músculo esquelético genes que regulan el transporte o la fosforilación de la glucosa. La glucoquinasa (GK) regula la captación de glucosa por el hígado y presenta una elevada Km para la glucosa. En nuestro laboratorio, hemos demostrado que la expresión de GK en el músculo esquelético de ratones transgénicos provoca un incremento en la utilización de glucosa y reduce la hiperglucemia diabética. En el presente estudio nos planteamos el transplante de miotubos manipulados genéticamente para expresar GK con el fin de reducir la hiperglucemia en animales diabeticos tratados con estreptozotocina (STZ). Estos miotubos presentan in vitro un incremento en el consumo y utilización de la glucosa que es dependiente de la concentración de glucosa en el medio. Su transplante a ratones sanos no altera el nivel de glucosa en sangre. Sin embargo, ratones transplantados con miotubos que expresan GK y tratados después con STZ contrarrestan la hiperglucemia, la polidipsia y la polifagia. En cambio, ratones transplantados con miotubos control desarrollan una diabetes abierta. Asimismo, ratones diabéticos a los que se transplanta miotubos control permanecen con hiperglucemia elevada. Por el contrario, el transplante de miotubos que expresan GK a ratones diabéticos normaliza la glucemia. Estos resultados sugieren que el uso de células musculares modificadas genéticamente para expresar GK puede proporcionar una nueva aproximación para el control de la glucemia en el tratamiento de la hiperglucemia diabética.
Proyecto financiado por: CICYT SAF 99-0094

Comunicación 21

PERMANENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA IN VIVO EN TRASPLANTES DE QUERATINOCITOS HUMANOS TRANSDUCIDOS POR VECTORES RETROVIRALES.

Marcela Del Rio, Fernando Larcher, Marta García, Marta Muñoz, Fernando Serrano y José Jorcano. Departamento de Biología Celular, Molecular y Terapia Génica. CIEMAT y Fundación Marcelino Botín para Terapia Génica. Madrid.

Entre los tejidos accesibles para la manipulación génica, la piel presenta propiedades que la convierten en un sistema muy atractivo, donde introducir genes que produzcan proteínas de forma estable. Sin embargo, numerosos intentos experimentales de terapia génica cutánea se han frustrado por la imposibilidad de mantener la expresión del transgén in vivo por tiempos prolongados. Como causas potenciales de la dificultad de mantener la expresión cuando se emplean vectores retrovirales, se ha señalado 1) la deficiente transducción de células stem epidérmicas, 2) la inactivación de los LTR retrovirales y 3) la pérdida con el tiempo del propio trasplante. Con el propósito de solventar este problema describimos aquí un protocolo optimizado que combina el enriquecimiento al 100% de la población de queratinocitos transducidos con el uso de una matriz dérmica basada en fibrina y una nueva técnica de trasplante de la piel artificial manipulada genéticamente. Este protocolo ha permitido regenerar de forma ortotópica piel humana en la espalda de ratones NOD/SCID a partir de queratinocitos transducidos con un vector retroviral que codifica para la proteína verde fluorescente (EGFP). La iluminación del ratón con luz azul a nivel del trasplante hizo posible el seguimiento in vivo de la piel humana modificada a lo largo del estudio. Después de 22 semanas de trasplantada (el tiempo máximo evaluado), la piel humana seguía siendo positiva para EGFP. Teniendo en cuenta que la epidermis se regenera completamente cada 4 semanas, una expresión mantenida por tiempos tan prolongados es una fuerte indicación de transducción de células stem epidérmicas. Los queratinocitos manipulados genéticamente no sufrieron alteraciones de su capacidad proliferativa/clonogénica generando in vivo un epitelio estratificado con un estrato granuloso y corneo bien diferenciado. De forma destacable, en estos trasplantes la aparición de papilas intradérmicas, características de una piel humana madura, ocurrió tan pronto como 4 semanas después del trasplante (7-8 semanas post-infección). El aspecto histológico de los trasplantes modificados genéticamente es consistente por un lado con la transducción exitosa de células stem y por otro con la permanencia en el ratón de una piel humana saludable por períodos prolongados.

Comunicación 22

IMMUNE RESPONSES TO DYSTROPHIN AFTER PLASMID DIRECT INJECTION.

Aurora Ferrer, Kim E. Wells & Dominic J. Wells.

Gene Targeting Unit. Department of Neuromuscular Diseases, Imperial College, Charing Cross Hospital. London ,UK.

The expression of human dystrophin after direct plasmid injection in the mdx mouse, evokes an immune response that eliminates the dystrophin transfected fibres, whereas a long term expression of human dystrophin is present in the immunodeficient mdx/nude at the same time point. The humoral and cytotoxic response is characterised by the presence of IgG specific antibodies to dystrophin and the presence of CD8+ clusters of cells surrounding the transfected fibres. However, fibres transfected with mouse dystrophin stay intact for at least 10 weeks after the last injection (Ferrer et al, in press). We think that this tolerance to mouse dystrophin is due to the presence of revertant dystrophin positive fibers in the mdx muscle. Several sources have reported the presence of "revertant" fibres in human patients. If this is the key to avoid immune responses to dystrophin in gene therapy, patients will have to be carefully selected. Those with small deletions or point mutations in the DMD gene that also have "revertant" fibres, could be tolerant to the dystrophin arising from gene therapy. To further study this, we are mimicking some of these situations using transgenic mice that express truncated versions or the full length dystrophin (Wells et al., Hum. Mol. Genet. 1995 1:35-40). When plasmid encoding human mini-dystrophin is injected into human minidystrophin transgenic mice, the number of dystrophin positive fibres 4 weeks after injection is similar to the number in the immunodeficient nude mice and clearly higher than in mdx mice, despite the production of a small antibody titre. A similar result is observed when the full-length construct is injected suggesting the possibility of tolerance to the newly presented epitopes. These preliminary findings suggest that patients expressing truncated versions of dystrophin may be tolerant to the full-length protein.

Comunicación 23

TRANSFERENCIA DEL GEN WASP MEDIANTE VECTORES RETROVÍRICOS A CÉLULAS B DE PACIENTES CON SÍNDROME DE WISKOTT-ALDRICH.

Josep M. Aran¹, Núria Andreu¹, Cristina Alemany², Carles J. Ciudad², Xavier Estivill¹, Cristina Fillat¹.

¹Centre de Genètica Mèdica i Molecular. Institut Recerca Oncològica. L'Hospitalet de Llobregat.²Dep. Bioquímica i Biologia Molecular. F.Farmàcia. U.Barcelona. Barcelona.

El síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es un defecto genético de tipo recesivo y ligado al cromosoma X que se debe a mutaciones en el gen WASP. La clínica de la enfermedad cursa con inmunodeficiencia, trombocitopenia y eccema. Por lo general, si no se instaura un tratamiento los niños afectados no sobreviven a los diez años. El tratamiento más adecuado consiste en el trasplante alogénico de médula ósea. Con ello se consigue la curación definitiva de la enfermedad. Sin embargo, a pesar de la efectividad del trasplante, existe una extrema dificultad para encontrar donantes histocompatibles por lo que la terapia génica constituiría un sistema alternativo potencialmente eficaz para revertir las manifestaciones de dicho síndrome. En nuestro grupo se han estudiado 13 familias españolas con WAS y se han identificado 10 mutaciones distintas. Nueve mutaciones de tipo missense, dos mutaciones de tipo nonsense, una deleción y una inserción. La mutación R86H y la mutación E133K se han seleccionado para los estudios de transferencia génica de acuerdo a su diferente presentación clínica. Pacientes con la mutación R86H presentan un fenotipo moderado y una función de la proteína WASP parcialmente inhibida. La mutación E133K conduce a un fenotipo severo de la enfermedad y está asociado a una expresión nula de la proteína WASP. Para valorar la efectividad de la transferencia del gen WASP en la corrección del fenotipo WAS se ha construido un retrovirus recombinante que contiene el gen WASP y se han transducido células B de pacientes con la mutación R86H y E133K. Se ha demostrado expresión del gen transferido a nivel de proteína, tanto por estudios de western blot como por inmunofluorescencia. La transferencia del gen WASP ha dado lugar a un incremento en la polimerización de F-actina citoplasmática, una de las alteraciones principales en dichas células. Además se ha determinado que la sobreexpresión de WASP, en las células transducidas, conlleva la inducción de diferentes genes celulares. Estos resultados destacan la utilidad potencial de la transferencia génica mediante vectores retrovíricos para la terapia de WAS.

Comunicación 24

OPTIMIZACION DE LA INCORPORACION DE QUIMERAPLASTOS PARA LA CORRECCION DE MUTACIONES PUNTUALES EN UN MODELO CELULAR DE FIBROSIS QUISTICA.

D. de Semir¹, A. Avinyó¹, J. Pétriz², S. Larriba¹, V. Nunes¹, T. Casals¹, X. Estivill¹ y J.M. Aran¹.

¹Centre de Genètica Mèdica i Molecular y ²Centre de Teràpia Cel.lular. Institut de Recerca Oncològica (IRO). LHospitalet de Llobregat. Barcelona .

Aunque se han realizado avances farmacológicos importantes en el tratamiento de la fibrosis quística, todavía no se ha logrado la reversión definitiva de sus manifestaciones pulmonares, las más importantes de esta enfermedad. Se están ensayando diversas modalidades de terapia génica basadas en la adición de copias normales del gen CFTR a las células epiteliales pulmonares de pacientes afectados que, sin embargo, no están produciendo la eficacia terapéutica esperada. Recientemente se ha descrito una nueva y prometedora estrategia de terapia génica basada en la corrección in situ de mutaciones utilizando oligonucleótidos quiméricos de RNA/DNA, también llamados quimeraplastos (Cole-Strauss et al. 1996 Science 273:1386-9). Una condición necesaria para lograr la máxima eficacia terapéutica de dichos oligonucleótidos es la de establecer los parámetros adecuados para que lleguen intactos al núcleo de las células diana y a concentraciones capaces de estimular los mecanismos de reparación nuclear. Con el fin de estudiar la incorporación y estabilidad de los quimeraplastos en un modelo celular de fibrosis quística (células epiteliales bronquiales IB3.1, de fenotipo ∆F508/W1282X), se marcó un oligonucleótido RNA/DNA de 68nt en posición 5 con FITC y se vehiculizó utilizando tres vectores no víricos: los lípidos catiónicos Citofectin (GS2888/DOPE) y GenePorter (XG40/DOPE), y el policatión PEI. Mediante citometría de flujo hemos establecido las relaciones óptimas quimeraplasto/vector para lograr una eficiencia de transfección cercana al 100% para cada uno de los vectores, con ausencia de toxicidad. Las cinéticas de incorporación de los diferentes complejos resultaron similares, alcanzándose la saturación en 6 horas. Al analizar la distribución del quimeraplasto en las células IB3.1 mediante microscopía confocal se detectó la ausencia de incorporación nuclear del quimeraplasto asociado a GenePorter, lo cual sugiere que dicho vector no es adecuado para abordar experimentos de corrección mediada por quimeraplastos. Se ha examinado también la estabilidad intracelular de dichas moléculas de manera cuantitativa mediante PAGE, utilizando un secuenciador ABI PRISM 377 y GeneScan Analysis software. Ensayos realizados a las 48 horas post-transfección revelaron que los lipoplejos de Citofectin conferían a los quimeraplastos una mayor protección frente a degradación que los poliplejos de PEI (14% versus 34% de degradación, respectivamente). Se detectó en ambos casos la existencia de un patrón de degradación típico de exonucleasas en los dominios de DNA situados en los extremos 5 y 3 del quimeraplasto. Teniendo en cuenta estos resultados, hemos iniciado experimentos para averiguar la eficacia correctora de quimeraplastos dirigidos hacia la mutación W1282X presente en las células IB3.1.

Proyecto financiado por la Fundació La Marató de TV3 y lAssociació Catalana de Fibrosi Quística

Comunicación 25

TIPAJE DE PACIENTES ESPAÑOLES CON ANEMIA DE FANCONI MEDIANTE TRANSDUCCIÓN DE LINFOCITOS T PERIFÉRICOS CON VECTORES RETROVIRALES.

José A. Casado,^* María L. Lamana,^* José C. Segovia,^* Jordi Surrallés, Stephan Lobitz,^§ Helmut Hanenberg^§ y Juan A. Bueren^*.

^*Programa de Terapia Génica CIEMAT/Fundación Marcelino Botín, Madrid, Departamento de Genética U.A.B., Barcelona y ^§Children's Hospital/Heinrich Heine University, Dusseldorph, Alemania.

La Anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva que origina aplasia medular y alta predisposición tumoral. Esta patología puede ser causada por mutaciones en cualquiera de los 8 genes actualmente identificados, 5 de los cuales ya han sido clonados. Se ha estimado que el porcentaje de pacientes con mutaciones en FANC-A es del 65%, 13% en FANC-C y 12% en FANC-G, estimándose que el 10% restante se debería a mutaciones en cualquiera de los otros 4 genes. La terapia génica es una nueva alternativa para los pacientes AF que no pueden beneficiarse de un transplante alogénico de progenitores hematopoyéticos. No obstante, previamente a cualquier consideración de terapia génica, es necesario conocer el gen responsable de la enfermedad de cada paciente. Las limitaciones inherentes a la generación de líneas linfoblastoides de estos pacientes y la heterogeneidad en las mutaciones y deleciones observadas en estos genes - principalmente en FANC-A - dificultan el tipaje tanto por métodos de fusión con líneas celulares de referencia como por métodos de análisis de DNA. Para caracterizar los genes FANC implicados en la AF de pacientes españoles, se ha utilizado un método alternativo que evita los problemas metodológicos anteriores. Este método se basa en la transducción de linfocitos T de sangre periférica con vectores retrovirales que contienen, respectivamente, los cDNA de los genes FANC-A, FANC-C, FANC-F y FANC-G. Los linfocitos T transducidos son entonces tratados con mitomicina C (MMC), analizándose la superviviencia y establidad cromosómica de los mismos. Hasta el momento se han analizado 8 pacientes, en 6 de los cuales se identificó al gen FANC-A como el responsable de su enfermedad. En los dos restantes las células T fueron resistentes a MMC, probablemente como consecuencia del mosaicismo con poblaciones que habrían revertido

la mutación, por lo que no han podido ser genotipados.

Comunicación 26

UNA APROXIMACIÓN EXPERIMENTAL PARA EL TRATAMIENTO GENÉTICO DE LA ANEMIA DE FANCONI.

Paula Río, Hans Joenje, Fre Artwert, Jesús Martínez, Juan A. Bueren y José C. Segovia.

Programa de Terapia Génica. Fundación M. Botín/CIEMAT. Madrid.

La Anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad caracterizada por malformaciones congénitas, aplasia medular y alta susceptibilidad a cáncer. El tratamiento de elección para estos pacientes es el trasplante alogénico de células hematopoyéticas. No obstante, son diversas las características que hacen a esta enfermedad adecuada para su tratamiento mediante terapia génica de células hematopoyéticas: es una enfermedad monogénica recesiva, la principal afectación se manifiesta en el tejido hematopoyético, y por último, existen evidencias de que las células corregidas desarrollan ventaja proliferativa respecto a las células homocigotas para la mutación. Con objeto de realizar estudios preclínicos sobre la eficacia terapéutica asociada a la transferencia de los genes FANC a las células madre hematopoyéticas se ha desarrollado un ratón knock-out para el gen FANC-A, sobre el que se han realizado estudios de funcionalidad hematopoyética. Así, mediante análisis de citometría de flujo se estudió la distribución de las diferentes subpoblaciones mieloides y linfoides en médula ósea, bazo, timo y sangre periférica. Estos análisis no mostraron la existencia de diferencias marcadas entre los ratones knock-out, heterocigotos y ratones normales. Mediante la realización de cultivos in vitro se analizó, asimismo, el contenido de precursores mieloides y megacariocíticos en médula ósea y bazo. Tampoco estos análisis mostraron la existencia de diferencias significativas entre los tres tipos de animales. Puesto que las células de pacientes de AF se caracterizan por su sensibilidad a agentes que producen entrecruzamientos de DNA, se ensayó la susceptibilidad de estos progenitores a mitomicina C (MMC). Estos análisis mostraron que los progenitores hematopoyéticos de ratones knock-out eran altamente susceptibles a la MMC, en comparación a lo observado en progenitores de ratones normales o heterocigotos. Se concluye que si bien el fenotipo hematopoyético de estos animales no reproduce la sintomatología observada en pacientes de AF, la hipersensibilidad de los progenitores hematopoyéticos humanos a MMC es mimetizada en los ratones knock-out para FANC-A. En base a este fenotipo, es posible evaluar la eficacia de protocolos de terapia génica basados en la transferencia del gen FANC-A a las células madre hematopoyéticas. Experimentos dirigidos a evaluar la corrección funcional de estas células con vectores retrovirales que expresan el gen FANC-A están actualmente en marcha.

Comunicación 27

LA EXPRESIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO SEMEJANTE A LA INSULINA I (IGF-I) ESPECÍFICAMENTE EN CÉLULAS ß CONTRARRESTA LA DIABETES TIPO 1

M. George, E. Ayuso, A. Casellas, C. Costa, J. Pareja, M. Moya, J. C. Devedjian y F. Bosch.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Universidad Autónoma de Barcelona.

Los pacientes diabéticos tipo 1 son diagnosticados cuando la destrucción de células ß es prácticamente completa. La regeneración de células ß a partir de células precursoras puede contrarrestar la diabetes tipo 1. Para ello, se requiere la identificación de factores que induzcan neogénesis y replicación de células ß, y prevengan de la destrucción autoinmune de los nuevos islotes. Este estudio demuestra que la expresión del factor de crecimiento semejante a la insulina I (IGF-I) específicamente en células ß en animales transgénicos (tanto de background genético C57Bl6/SJL como CD-1), contrarresta la citotoxicidad e insulitis después del tratamiento con múltiples dosis de estreptozotocina (STZ). Los animales controles tratados con STZ desarrollan una severa hiperglucemia, hipoinsulinemia, pérdida de peso corporal y mueren. Por contra, los animales transgénicos de background genético C57Bl6/SJL, tratados con STZ, muestran una hiperglucemia suave durante un mes, pero gradualmente normalizan la glucemia y sobreviven normalmente. Después del tratamiento con STZ, todos los ratones de background genético CD-1 desarrollan elevada insulitis, severa hiperglucemia (>600 mg/dl), hipoinsulinemia, polidipsia y polifagia. Sin embargo, los ratones transgénicos tratados con STZ, normalizan gradualmente todos los parámetros metabólicos y sobreviven más allá de los 8 meses. Esta normalización era paralela al incremento de la masa de células ß a través de la neogénesis y replicación de las mismas. Así, nuestros resultados indican que la expresión local de IGF-I en células ß puede contrarrestar la diabetes tipo 1. Este trabajo sugiere que la transferencia del gen del IGF-I al páncreas podría constituir una terapia adecuada para regenerar el páncreas endocrino y así revertir la diabetes tipo 1.

Proyecto financiado por: FIS (95/1758 y 98/1063), Fundación La Maratón de TV3 y Fundación Areces.

Comunicación 28

RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESAN IFNß EN CÉLULAS ß. UN MODELO PARA EL ENSAYO DE NUEVAS TERAPIAS PARA LA DIABETES TIPO 1

A. Casellas, E. Ayuso, M. Garcia, S. Franckhauser, M Moya, J. Pareja, G. Pascual y F.Bosch

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Universidad Autónoma de Barcelona.

La diabetes tipo 1 es el resultado de la destrucción autoinmune de las células ß pancreáticas. Se ha descrito que un cierto número de citoquinas alteran la funcionalidad de las células ß y están involucradas en el desarrollo de esta enfermedad. En islotes de pacientes diabéticos tipo 1 se ha detectado la presencia de interferón ß (IFNß). Ratones transgénicos que expresan IFNß en las células ß obtenidos en nuestro laboratorio presentan alterada la secreción de insulina y son más susceptibles a desarrollar diabetes. Los objetivos de este estudio eran, por una parte, obtener un modelo de diabetes autoinmune por tratamiento con bajas dosis de estreptozotocina (STZ) evitando así los efectos tóxicos que este compuesto provoca en otros tejidos como hígado y riñón. Y por otra, que estos ratones fueran perfectamente viables, fáciles de mantener y válidos para ensayar nuevas terapias. Para ello, hemos introducido el transgén INFß en ratones de background genético CD-1. Tras la administración de dosis muy bajas de STZ (15-20 mg/Kg peso), se observó que los ratones CD-1 que expresaban IFNß eran altamente sensibles a la STZ, y presentaban una gran infiltración linfocitaria de los islotes que llevaba a la destrucción de las células ß y a diabetes abierta. Con estas dosis no se detectó ningún efecto tóxico de la STZ en otros tejidos. Por otro lado, estas dosis de STZ no causaban diabetes en ratones control. Estos resultados indican que los ratones transgénicos que expresan IFNß en células ß podrían ser un buen modelo para ensayar protocolos, tanto de terapia génica como de terapia convencional, para la diabetes tipo 1.

Proyecto financiado por CICYT SAF 99-0094 y Fundación La Maratón de TV3.

Comunicación 29

INCREMENTO DE LA SENSIBILIDAD A LA INSULINA MEDIANTE LA SOBREEXPRESIÓN HEPÁTICA DE c-MYC EN ANIMALES TRANSGÉNICOS.

E. Riu, A. Hidalgo, T. Ferre, A.Mas y F. Bosch

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Universidad Autónoma de Barcelona.

El factor de transcripción c-Myc está implicado en el control in vivo del metabolismo hepático de carbohidratos, induciendo la captación y utilización hepática de glucosa y bloqueando la activación de la gluconeogénesis. Estos cambios en el metabolismo hepático de la glucosa llevan a una reducción en las concentraciones sanguíneas de glucosa e insulina. Ello se produce en ausencia de proliferación y transformación celular. De esta forma, los ratones transgénicos que sobreexpresan c-Myc en hígado podrían presentar un comportamiento similar al observado en un estado de alta sensibilidad a la insulina. Así, examinamos si la sobreexpresión hepática de c-Myc era capaz de contrarrestar la resistencia a la insulina que se produce tras un período de alimentación con una dieta alta en lípidos. Tras someter estos ratones transgénicos a una dieta alta en lípidos durante tres meses, observamos que mientras los ratones control mostraron un incremento del 40% en el peso corporal, los ratones transgénicos sólo presentaron un aumento del 20%. Además, los ratones control eran hiperglicémicos e hiperinsulinémicos, lo que indicaba que habían desarrollado un estado de resistencia a la insulina. Por el contrario, los ratones transgénicos mostraron niveles normales de glucosa y de insulina en suero. Al realizar un test de tolerancia intraperitoneal a la glucosa, los ratones transgénicos alimentados con la dieta alta en lípidos presentaron unos niveles más bajos de glucemia que los controles. Asimismo, estos ratones transgénicos mostraron una normalización de las actividades glucoquinasa y piruvato quinasa hepáticas, lo que llevaba a la normalización de las concentraciones de glucosa-6-P, lactato y glucógeno hepáticos. Además, los ratones transgénicos presentaron una marcada reducción en los niveles séricos de trigliceridos y ácidos grasos libres, siendo similares a los observados en los ratones control con dieta estándar. Estos resultados indicaban que la sobreexpresión de c-Myc en hígado sería capaz de contrarrestar un estado de resistencia a la insulina. Por tanto, la sobreexpresión hepática de c-Myc podría ser útil para contrarrestar el desarrollo de la obesidad y la diabetes tipo 2.

Proyecto financiado por FIS 98/1063 y UE (QLRT -1999-00674)

Comunicación 30

CONTRARRESTACIÓN DE LAS ALTERACIONES DIABÉTICAS MEDIANTE LA PRODUCCIÓN DE INSULINA POR EL MÚSCULO ESQUELÉTICO EN RATONES TRANSGÉNICOS.

E. Riu, A.Mas, T. Ferre, A. Pujol, L. Gros, P. Otaegui, L. Montoliu y F. Bosch.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Universidad Autónoma de Barcelona.

Los pacientes diabéticos de tipo 1 requieren una terapia sustitutoria con insulina, la cual es imperfecta, ya que no evita la aparición de las graves complicaciones secundarias. A fin de conseguir una terapia más efectiva para esta enfermedad, se podrían manipular genéticamente células musculares para que secretaran niveles basales de insulina. Hemos obtenido ratones transgénicos que expresan el mRNA de la proinsulina humana en el músculo esquelético con la finalidad de estudiar el control de la homeostasis de la glucosa en condiciones de alimentación y diabetes. Estos ratones transgénicos eran normoglucémicos y normoinsulinémicos en condiciones de alimentación. Sin embargo, en condiciones de ayuno presentaron un incremento en la concentración de insulina y una disminución de la glucemia. Asimismo, mostraron un test de tolerancia intraperitoneal a la glucosa mejorado respecto al de los animales control, indicando que la producción de insulina por parte del músculo esquelético llevaba a un aumento de la eliminación de la glucosa de la circulación. Así, la producción de insulina por el músculo esquelético podría contrarrestar la hiperglucemia diabética. Tras tratar a los animales con estreptozotocina (Stz), los ratones transgénicos mostraron un marcado incremento en la insulinemia, una marcada reducción de la hiperglucemia en condiciones de alimentación y normoglucemia en ayuno. Asimismo, tras la administración de bajas dosis de insulina exógena, los ratones control tratados con Stz permanecieron claramente hiperglucémicos, mientras que los ratones transgénicos tratados con Stz eran normoglucémicos, lo que indicaba que estos animales eran más sensibles a los efectos hipoglucemiantes de la hormona. Además, ratones transgénicos tratados con Stz presentaron normalización del metabolismo muscular y hepático de la glucosa en comparación a los ratones control. Estos resultados sugieren que la utilización de el músculo esquelético para que secrete continuamente un nivel definido de insulina podría constituir una aproximación adecuada para conseguir las necesidades basales diarias de insulina y, así, mejorar la eficacia del tratamiento con insulina en pacientes de diabetes tipo 1.

Proyecto financiado por CICYT SAF 96-0270 y FIS 98/1063

Comunicación 31

AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD A LA INSULINA Y PREVENCIÓN DE LA OBESIDAD MEDIANTE LA EXPRESIÓN DE GLUCOQUINASA EN EL MÚSCULO ESQUELÉTICO.

P. J. Otaegui, T. Ferre, E. Riu y F. Bosch

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica. Universidad Autónoma de Barcelona,

La diabetes tipo 2 se caracteriza por la disminución de la captación de glucosa estimulada por insulina en el músculo esquelético. Defectos en la fosforilación de la glucosa pueden ser los responsables de la baja captación de glucosa por este tejido. Para determinar si un incremento en la fosforilación de glucosa podría contrarrestar la resistencia a la insulina, se administró una dieta alta en lípidos a ratones transgénicos que expresan glucoquinasa (GK) en el músculo esquelético. La presencia de GK en el músculo esquelético de los ratones transgénicos llevó a un incremento en la concentración intramuscular de glucosa 6-fosfato y glucógeno. Además, tras 4 meses siendo alimentados con esta dieta, los ratones transgénicos presentaban un test de tolerancia intraperitoneal a la glucosa mejorado respecto a los animales control y no desarrollaron obesidad ni resistencia a la insulina, mientras que los ratones control ganaron peso rápidamente y se volvieron resistentes a la insulina. Todas estas observaciones confirman el papel clave de la disminución en la fosforilación de la glucosa en el desarrollo de diabetes tipo 2 y obesidad, y sugieren que la expresión de glucoquinasa en el músculo esquelético podría ser una nueva aproximación terapéutica para la diabetes tipo 2.

Proyecto financiado por: UE (QLRT-1999-00674) y FIS (98/1063)

Comunicación 32

LA ESTRATEGIA ANTISENTIDO DESDE UNA PERSPECTIVA QUIMICA.

Ramon Eritja

Instituto de Biología Molecular de Barcelona, C.S.I.C. Barcelona.

La capacidad de los oligonucleótidos sintéticos de unirse a secuencias complementarias se ha utilizado enormemente en el aislamiento, amplificación y detección de genes. En la década de los ochenta se demostró que esta capacidad se podía hacer servir también en para la inhibición selectiva de genes tanto in vitro como in vivo. Desde entonces hasta el momento presente se han desarrollado un número elevado de derivados de los oligonucleótidos sintéticos con el fin de mejorar su capacidad inhibitoria. En la presente comunicación se comentarán diversos proyectos realizados por el grupo en el desarrollo de nuevos derivados de los oligonucleótidos con posible utilización en la estrategia antisentido. Concretamente se describirá la experiencia del grupo en la preparación de oligonucleótidos con enlaces fosfato modificados, con bases modificadas y con modificaciones en el extremo 3. Finalmente se describirá la preparación de quimeras constituidas por oligonucleótidos o ácidos peptídicos nucleicos (PNA) y péptidos.

Comunicación 33

EFECTO CITOTÓXICO EN CÉLULAS HUMANAS DE CÁNCER DE MAMA DE INMUNOLIPOSOMAS TRANSPORTADORES DE OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO CONTRA EL RNA PARA LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA.

Mercè Rodriguez, Silvia Coma, Veronique Noé, Carlos J. Ciudad

Facultad de Farmacia. Universitat de Barcelona. Barcelona

Tomando como modelo el gen que codifica para la dihidrofolato reductasa (DHFR) hemos estudiado el efecto citotóxico de oligonucleótidos antisentido (aODN) contra el inicio de la traducción del RNA que codifica para este gen en líneas celulares humanas en cultivo. El producto de este gen es la diana del quimioterápico metotrexato. Como vehículo para la administración de estos aODN hemos utilizado inmunoliposomas (IL) catiónicos. Nuestro modelo celular consiste en dos líneas celulares humanas de cáncer de mama, SKBR3 y MCF7. La primera de ellas sobreexpresa la proteína de membrana p185. Esta proteína está codificada por el protooncogén HER2/c-erbB2/neu y se ha utilizado como diana de anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cáncer de mama metastásico. Para la obtención de los IL hemos seguido dos aproximaciones basadas en la afinidad existente entre biotina y estreptavidina. En la primera de ellas se parte de la molécula de DOPE (dioleilfosfatidiletanolamina) como lípido base y de estreptavidina. Se modifica covalentemente ambas moléculas con el objetivo de obtener un conjugado entre ellas, y se le añade el anticuerpo contra HER2 previamente biotinilado. Finalmente, se adiciona el complejo aODN/liposoma catiónico (DOTAP) a la mezcla anterior. La segunda estrategia consiste en formar un complejo ternario entre un aODN biotinilado, la estreptavidina sin modificar y el anticuerpo biotinilado. En este caso también se adiciona DOTAP antes de la incubación celular.

Se ha comprobado mediante citometría de flujo la incorporación celular de los IL, a pesar de los elevados pesos moleculares de sus componentes, especialmente en la segunda estrategia. En el caso de los IL obtenidos con el primer método, hasta un 60% de las células son positivas para la fluoresceína, mientras que con la segunda aproximación se consigue un 48% de positividad.

Con ambas estrategias se ha conseguido citotoxicidad selectiva en las células SKBR3 y no en las MCF7. Además, se ha conseguido incrementar la sensibilidad del aODN, ya que concentraciones inferiores a 100 nM son altamente efectivas.

Investigación subvencionada por: SAF99-120 (CICYT) y 2000SGR 00045 (CIRIT).

Comunicación 34

SPECIFIC INHIBITION OF BCR-ABLP190 CELLS BY RETROVIRALLY TRANSDUCED ANTISENSE TRANSCRIPTS IN TRANSGENIC MICE

A. Rodríguez-García, J. Pérez-Losada, M. Sánchez-Martín, B. Pintado, and I. Sánchez-García.

Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer. CSIC/ Universidad de Salamanca.

The main problem facing the effective treatment of patients with cancer is to distinguish between tumour and normal cells. The chimaeric molecules created by cancer-associated chromosomal abnormalities (BCR-ABL, in our case) are ideal therapeutic targets since they are unique to the disease. A major problem is how to get the specific anti-tumour drug into every tumour cell. In this report we describe the use of a novel strategy to introduce specifc anti-tumour reagent into every tumour cells, which uses retroviral vectors encoding both specific antisense transcripts to the BCR-ABLp190 fusion junction (the specific anti-tumour drug) and a truncated human CD5 cDNA, which allows to select only the infected cells. In order to co-express the antisense molecule with the truncated human CD5 gene, we have taken advantage of the picornaviral internal ribosome-entry site. Transgenic mice expressing BCR-ABLp190 or BCR-ABLp210 oncogenes under the control of the metallothionein promoter were used as models to study the in vivo therapeuthic efficiency of this strategy. Bone marrow transduced cells were selected by sorting using anti-human CD5 antibodies and used to reconstitute the hematopoietic system of lethally irradiated MT-p190 or MT-p210 mice, respectively. MT-p210 mice were used as negative controls, together with MT-p190 mice that were reconstituted with cells transfected with sense-p190 RNA molecules. The disease phenotype of untreated MT-p190 mice is characterized by a spleen disease, with the BCR-ABLp190 transgene expression being detected in cells both by RT-PCR and western blotting. This phenotype is completely reverted by the retrovirally transduced antisense RNA molecules, and four months after transplantation there are no signs of spleen disease, retrovirus expression is found in blood cells and BCR-ABLp190 mRNA and protein cannot be detected (10 mice). Sense-p190-reconstituted MT-p190 mice (10 mice) develop spleen disease with oncogene expression in blood tissues, although retroviral expression is maintained at four months. The 12 MT-p210, antisense-treated mice develop the disease phenotype that appears normally in these untreated mice (T-and B- cell lymphomas and thymomas), although retroviral expression is also maintained. The reversion of phenotype caused by the antisense molecules disappears at 10-12 months after transplantation, and the lost of the therapeutic effect is associated with the lost of expression of the retrovirus and a reappearance of BCR-ABLp190 protein, as detected by RT-PCR and western blotting. In summary, antisense RNA against the fusion messenger inhibits the tumoral phenotype of transduced cells as long as the retroviral promoter that drives its expression remains active (9-10-months). These data edify a novel strategy for cancer treatment incorporating the use of retrovirus which enables dual expression of both a selectable marker and the tumour specific drug.

Comunicación 35

INGENIERÍA DE RIBOZIMAS.

Alfredo Berzal-Herranz, Alicia Barroso del Jesus, Elena Puerta-Fernández y Cristina Romero-López

Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC. Granada

La tecnología antisense se ha mostrado como una de las aproximaciones experimentales más prometedoras para posibilitar la actuación directa sobre la información genética responsable de muchas enfermedades y trastornos fisiológicos, contra las que actualmente no se dispone de un tratamiento terapéutico eficaz. En concreto, está extensamente probado que se pueden desarrollar inhibidores específicos de la expresión génica mediante la manipulación de los RNAs catalíticos o ribozimas naturales. Sin embargo, hasta la fecha no existen estrategias o principios generales básicos que puedan utilizarse para el diseño eficiente de estas moléculas. En contra de la metodología utilizada mayoritariamente, que se basa en ensayos de prueba y error, nosotros proponemos el establecimiento de estrategias de diseño racional de los mismos. Como primera aproximación, estamos trabajando en la caracterización de RNAs antisense catalíticos. El uso eficiente de ribozimas requiere necesariamente que los motivos catalíticos interaccionen eficazmente con sus secuencias blanco. Esta es la característica fundamental de los RNAs antisense naturales. Se ha descrito que la presencia del dominio YUNR expuesto al final de una estructura estable tipo tallo-lazo es responsable de la rapidez y especificidad de unión del antisense a su diana. Hemos construido y caracterizado una colección de RNAs antisense catalíticos basados en las ribozimas tanto tipo hairpin como hammerhead, demostrando que la presencia de un dominio tipo tallo-lazo estable en el extremo 3' de estas ribozimas conduce a un aumento de su actividad catalítica. La interacción de este dominio antisense con su correspondiente diana facilita el acceso del dominio catalítico a su sitio específico de corte dentro de un RNA substrato, aumentando así tanto la tasa de procesamiento como la especificidad del RNA catalítico. En concreto hemos demostrado la utilidad de la región TAR para actuar como sitio de anclaje de ribozimas dirigidas frente a RNAs del VIH. Estos resultados nos llevan a proponer un diseño racional de los RNAs antisense catalíticos frente a la extensión aleatoria de los dominios del ribozima implicados en el reconocimiento e interacción del substrato. En una segunda aproximación, encaminada al desarrollo de RNAs inhibidores más eficientes estamos caracterizando RNAs catalíticos que combinan su actividad catalítica con la capacidad de actuar como moléculas decoy. Resultados preliminares indican que ribodecozimas que combinan la capacidad catalítica del dominio tipo hairpin con la capacidad de secuestrar la proteína Tat, pueden ser buenos candidatos para el diseño de RNAs anti-HIV.

Comunicación 36

INACTIVACION FUNCIONAL DE CCR5 MEDIANTE TRANSFERENCIA GENICA RETROVIRAL

Jose Luis Abad, Manuel A. González, Fernando Serrano, Emilia Mira, Rosana Lacalle, Santos Mañes, Antonio Bernad.
Departamento de Inmunología y Oncología. Centro Nacional de Biotecnología. Universidad Autonoma de Madrid.

Las quimioquinas y sus receptores juegan un importante papel en la regulación de la respuesta inmune, determinando la naturaleza de ésta en diferentes procesos. En concreto, el receptor de quimioquinas CCR5 se expresa en monocitos y en ciertas subpoblaciones de linfocitos T, como por ejemplo las células Th1, implicadas en procesos de respuesta inmune celular, inflamación, rechazo, autoinmunidad organoespecífica o artritis.

Por otro lado, el interés por ciertas quimioquinas y sus receptores ha aumentado desde que se conoce su papel determinante en la infección por HIV-1. En 1995 se identificaron tres quimioquinas, RANTES, MIP1-alfa y MIP1-beta, ligandos de CCR5, como los factores solubles producidos por linfocitos T CD8+ capaces de inhibir la replicación de cepas primarias de HIV-1 en células CD4+. Poco después se confirmó el papel de CCR5 como principal correceptor de las cepas monocitotrópicas (R5) de HIV-1, responsables de la infección primaria. Estudios clínicos han permitido la identificación de individuos homozigotos para un alelo inactivo de CCR5 (Delta32-CCR5), inmunocompetentes y resistentes a la infección por HIV-1, lo que convierte a CCR5 en una diana ideal para terapias anti-HIV que impliquen su inactivación. Hemos generado varias construcciones con potencial capacidad para anular la expresión de CCR5 en la membrana celular, que podrían ser aplicadas en protocolos de terapia génica para el tratamiento de la infección por HIV-1 o de procesos inflamatorios crónicos como la artritis. En experimentos de cotransfección con estos plásmidos y otro que expresa CCR5 desde el mismo promotor (CMV) hemos obtenido información sobre las construcciones más eficientes, que consisten en: a) ribozima tipo "hammerhead" (RzR5-76) específica del ARNm de CCR5 b) el ligando natural RANTES con secuencias de retención en RER (tetrapéptido KDEL) c) una forma truncada de CCR5 similar a la aislada en humanos que debe actuar como "dominante negativo" y d) construcciones mixtas de RANTES intracelular y la ribozima o la variante truncada de CCR5 respectivamente. Todas estas moléculas se han incluído en vectores retrovirales bicistrónicos - pLZR-IRES-GFP - que contienen la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador seleccionable. Cuando los correspondientes sobrenadantes retrovirales se utilizan para infectar la línea MCF-7, son capaces de inhibir de manera significativa - más del 50% - la migración mediada por CCR5. Son especialmente interesantes la Ribozima, RANTES-KDEL y su combinación con la variante truncada de CCR5.La expresión de estas moléculas por transducción retroviral en linfocitos humanos estimulados en condiciones fisiológicas, reduce sensiblemente (70-100% inhibición) la expresión de CCR5 en su membrana. Tienen una acción especialmente destacada las construcciones consistentes en la fusión de RANTES con la variante truncada de CCR5 y la construcción que combina RANTES-KDEL y la ribozima. Esta última tiene una acción dual, a nivel de ARN mensajero y de proteína en retículo endoplásmico. Actualmente estamos evaluando la capacidad de estas construcciones para bloquear la capacidad de HIV-1 para infectar células CD4+.

Comunicación 37

Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC)

mediante la RNasa P humana

Anna Nadal, María Martell, J.Robin Lytle^*, Hugh D. Robertson^*, Beatriz Cabot, Juan I. Esteban, Rafael Esteban, Jaime Guardia, Jordi Gómez.

Departamento de Medicina Interna-Hepatología, Hospital Vall d'Hebrón, Barcelona *Department of Biochemistry, Weill Medical College of Cornell Univ., New York

El VHC es extremadamente variable in vivo: en el paciente infectado la población viral está formada por una mezcla compleja de mutantes muy relacionadas entre si pero que difieren en uno o más nucleótidos. La RNasa P humana endógena podría tener un gran valor terapéutico para inactivar el VHC ya que su especificidad por el substrato no radica en secuencias determinadas sino en las características estructurales del ARN. Se ha demostrado recientemente, que mediante el uso de secuencias guía externas (EGS) que hibridan con el ARN diana y mimetizan estructuras de tRNA, podemos convertir cualquier ARN en substrato de la RNasa P. Nosotros hemos encontrado que la actividad ribozímica de la RNasa P purificada a partir de extractos de células HeLa, corta el genoma ARN del VHC de manera eficaz y en ausencia de secuencias guía externas. Para probar que la actividad de corte sobre el VHC se debe a la RNasa P y no a otras RNasas inespecíficas, se han utilizado métodos directos (i) e indirectos (ii):

(i) el método de fingerprinting y el análisis químico del ARN cortado y no cortado ha revelado que 1) el corte ocurre entre dos bases específicas, 2) el enzima corta dejando un nuevo extremo fosfato en 5'.

(ii) 1) Las fracciones en las que se observa mayor porcentaje de corte sobre el VHC coinciden con las fracciones purificadas que contienen el pico de actividad RNasa P, 2) el pre-tRNA (substrato natural de la RNasa P) inhibe en un 50% el corte del ARN del VHC en una relación molar de 1:1, 3) la imnmunoprecipitación de la RNasa P con un suero con anticuerpos anti-Th, elimina la actividad de corte en el sobrenadante para encontrarla en el inmunoprecipitado. Además, secuencias master de VHC, procedentes de cuatro individuos distintos, portadoras de mutaciones en el sitio de corte exacto o en sitios adyacentes fueron todos substratos sensibles al enzima humano.

La posible exsistencia de estructuras de tipo tRNA en el genoma del VHC, sensibles a la RNasa P humana, podrían ser dianas terapéuticas para el desarrollo de nuevas estrategias antivirales. Se pretende aprovechar la posible vulnerabilidad de estas estructuras para dirigir hacia ellas el RNA catalítico (M1) de la Ribonucleasa P de E.coli.

Comunicación 38

EFECTO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO CONTRA cd4 SOBRE LINFOCITOS DE RATA TRATADOS CON PMA

M.Rabanal, C. Pelegrí, A. Franch, C. Ciudad*, V. Noé*, C. Castellote, M. Castell.

Dept. Fisiologia-Divisió IV. *Dept.Bioquímica i Biologia Molecular-Divisió IV. Facultat de Farmàcia. Universitat de Barcelona.

Los anticuerpos monoclonales (AcMo) dirigidos contra la molécula CD4 constituyen una herramienta terapéutica para la inducción de tolerancia en enfermedades autoinmunes y trasplantes. No obstante, dichos anticuerpos no están exentos de efectos secundarios. Como alternativa, el objetivo de este trabajo se ha centrado en modular la molécula CD4, en linfocitos de rata, mediante oligonucleótidos antisentido (A-ODN) dirigidos contra el inicio de la traducción del gen cd4. Se han ensayado dos oligonucleótidos antisentido: ODN-CD4_in1 con modificaciones fosforotioato en todas sus bases y ODN-CD4_in2, con la misma secuencia y modificaciones fosforotioato en determinadas bases. Como control se ha empleado un tercer ODN con la misma composición de bases, pero con una secuencia al azar (ODN-CD4 Scr). Como vehículo de ODN se ha utilizado el liposoma catiónico DOTAP.

El efecto de los ODN se ha ensayado sobre linfocitos esplénicos de rata. Para inducir la síntesis activa de CD4, las células, una vez aisladas y en cultivo, se han tratado con acetato de tetradecanoilforbol (PMA) 80 nM de forma simultánea a la incubación con el ODN correspondiente. La cuantificación de la expresión de la molécula CD4 se ha realizado mediante marcaje con AcMo anti-CD4 conjugado a FITC, análisis por citometría de flujo y cuantificación de la intensidad media de fluorescencia de cada muestra. La incorporación del ODN con el liposoma se ha comprobado utilizando un ODN conjugado a FITC. Se han ensayado concentraciones comprendidas entre 125 nM y 1,5 mM de ODN y se ha determinado el efecto a las 24 h.

La adición de PMA reduce en un 45 % la expresión de superficie de la molécula CD4 en linfocitos. El efecto es máximo a las 4 h y la externalización se inicia, gradualmente, a partir de las 12 horas. La adición de ODN-CD4_in1 y ODN-CD4 Scr no modifica la reexpresión de la molécula CD4 a las 24 h. Por el contrario, ODN-CD4_in2 produce una inhibición del 35% sobre la expresión global de la molécula CD4, que constituye un 75% de inhibición sobre la reexpresión inducida por PMA.

El compuesto de síntesis ODN-CD4_in2 se presenta como una posible estrategia alternativa a los AcMo, con el fin de alcanzar una inmunomodulación "in vivo" de linfocitos CD4⁺.

Comunicación 40

ADENOVIRUS MEDIATED GENE TRANSFER OF INTERLEUKIN-12 (IL-12) AND INTERFERON GAMMA INDUCIBLE PROTEIN 10 (IP-10) DISPLAYS POTENT ANTITUMOR EFFECTS.

I.Narvaiza, G. Mazzolini, M. Barajas, M Duarte, C. Qian, I. Melero and J. Prieto.

Unidad de Terapia genica. Dpto. de Medicina Interna. Universidad de Navarra. Pamplona.

We have demonstrated that adenovirus-mediated gene transfer of IL-12 is highly efficacious for the treatment of metastasis of a murine colon carcinoma cell line. However, dose dependent toxicity of IL-12 compromises safety. Interferon gamma inducible protein 10 (IP-10), an a-chemokine associated to inflammatory processes with antitumoral activity related to its angiostatic and chemotactic properties is important for the antitumoral effects of IL-12. We have construct a recombinant adenovirus expressing murine IP-10 in order to analyse the antitumor effects of IP-10 and its possible synergy with AdCMVIL-12 for treatment of gastrointestinal cell lines derived tumors. Intratumoral injection of AdCMVIP-10 into intrahepatic or subcutaneous nodules shows a very limited antitumoral effect. Combination of intratumoral injection of the hepatic malignant nodule and i.v. adoptive transfer of antitumor T-lymphocytes induces tumor eradication in 35% of the cases associated to 30% survival at day 100. Adoptive transfer of T-lymphocytes by itself lacked any effect. AdCMVIP-10 synergizes with the antitumor effect of suboptimal dosis of AdCMVIL-12 reaching 100% of tumor eradication not only against injected but also against distant non injected tumor nodules in a CT26 cells model. Colocalization of both adenovirus at the same tumor nodule was required for the local and distant therapeutic effects. Importantly, intratumoral gene transfer with IL-12 and IP-10 generated a powerful tumor specific CTL response in a synergistic fashion and immunological memory. Moreover, the antitumor activity of IP-10 + IL-12 combined gene therapy was greatly diminished by simultaneous in vivo depletion of CD4+ and CD8+ T-cells but was largely unaffected by single depletion of each T-cell subset. In conclusion, despite of limited therapeutic effects of AdCMVIP-10 when used as single agent, shows a 100% of efficacy when combined with suboptimal doses of AdCMVIL-12 both at treated and non treated nodules in the CT26 tumor cells model and improves the efficacy of AdCMVIL-12 in a MC-38 tumor cells model.

Comunicación 41

RETROVIRUS-MEDIATED TRANSFER OF THE HERPES SIMPLEX VIRUS THYMIDINE KINASE AND CONNEXIN 26 GENES IN PANCREATIC TUMOR CELLS. IMPLICATIONS FOR GENE THERAPY.

M. Carrió¹, A. Mazo², C. López-Iglesias³, X. Estivill¹ and C. Fillat¹

1 Centre Genètica Mèdica i Molecular, (IRO).L'Hospitalet de Llobregat. Barcelona. 2 Dep. Bioquímica. i Biologia Molecular. Univ. Barcelona. 3 S.Cientificotècnics (Parc Cientìfic). U. Barcelona,

A candidate approach for the treatment of pancreatic cancer may involve the use of prodrug-activating genes such the herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-tk) in combination with ganciclovir (GCV). In the present study, we have evaluated the efficacy of the HSV-tk/GCV treatment in a panel of pancreatic tumor cell lines (NP-9, NP-18, NP-31) and the potentiation of the cytotoxic effect in combination with the overexpression of the connexin 26 gene (Cx26). Pancreatic cells transduced with a retrovirus containing the HSV-tk gene showed different sensitivities to GCV which seemed to be independent of HSV-tk expression levels. The extent of the bystander effect also varied among the pancreatic tumor cells and correlated with the level of gap junction intercellular communication (GJIC). Pancreatic tumor cells overexpressing the connexin 26 led to an increase in the GJIC which correlated to an extent in the bystander effect in both NP-9Cx26 and NP-18Cx26 cells. However, neither an increment in GJIC nor an increase in the bystander killing was detected in NP-31Cx26. The bystander effect in NP-18 Cx26 cells was also prevented by the long term inhibitor of GJIC, 18-a-glycyrrhetinic acid (AGA). Together, these results demonstrate that pancreatic tumor cells are highly variable as regards the susceptibility to HSV-tk/GCV treatment. Moreover, they indicate that overexpression of the Cx26 gene does not always correspond to an increase in GJIC although they clearly suggest the role of GJIC in mediating the bystander effect.

Then, the potential application of pancreatic cancer gene therapy with the HSV-tk/GCV system may require, for an individual tumor, in vitro testing of the suicide effect and the degree of GJIC.

Comunicación 42

ADENOVIRUS-MEDIATED EXPRESSION OF TUMOR SUPPRESSOR GENES (p53, p16, p21 and pRb) IN HUMAN PANCREATIC CELL LINES WITH DIFFERENT PATTERN OF GENETIC ALTERATIONS.

J. Calbó, J.M. Roig, M. Cascalló and A. Mazo.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.

The development of new therapies is particularly urgent to improve the bad prognosis in pancreatic cancer. New approaches involving tumor suppressor gene replacement appear very encouraging. Previous results have demonstrated that genetic background determines the response to adenovirus-mediated wt-p53 expression in pancreatic tumor cells (1). Here, we have evaluated the effectiveness of adenovirus-mediated expression of different tumor suppressor genes (p53, p16, p21 and pRb) in the induction of cell cycle arrest and/or apoptosis on a panel of pancreatic cell lines with different pattern of genetic alterations.
Western blot and immunofluorescence analysis confirmed the expression of all exogenous proteins and allowed us to assess the intracellular localization of these proteins. Flow cytometry and annexin-V binding were used to determine the extension of the cycle arrest and apoptosis, respectively. The tumor suppressor proteins expressed provoked significant inhibitions of cell growth but the molecular mechanisms responsible of these effects were different. Additive or synergic responses were observed when these suppressor activities were combined, but the genetic background of transduced cells determined the kind and/or the extension of the response.

The overall results indicate that these approaches could represent promising therapeutic approaches for pancreatic cancer but it will be critical to know the pattern of genetic alterations of the tumor before to choose the molecular strategy.

Supported by Plan Nacional de Salud, Spain.

(1) Cascalló M. et al. Cancer Gene Therapy 6 (5), 428-436 (1999).

Comunicación 43

STRATEGIES TO ACCOMPLISH TARGETED EXPRESSION OF TRANSGENES IN OVARIAN CANCER FOR MOLECULAR THERAPEUTIC APPLICATIONS

E. Casado, J. Gómez-Navarro, M.Yamamoto, Y. Adachi1, C. Balague1, R. Alemany1, A. Redondo, C. Belda, G. Siegal, R. Alvarez,M. González Barón, DT Curiel.

Servicio de Oncología Médica, Hospital La Paz, Madrid.

OBJECTIVES: To determine the capability of the promoter regions of the midkine (MK) and cyclooxigenase-2 (Cox-2) genes to function as tumor-specific promoters (TSPs) for use in targeted gene therapy of ovarian cancer.

METHODS: Established and primary ovarian cancer and mesothelial cells were transduced by adenoviral vectors containing a reporter or thymidine kinase gene expressed under the control of the MK, Cox-2 or CMV promoters. Primary ovarian cancer cells were purified from ascitis, following an immunomagnetic procedure developed at our laboratory. Adenoviral vectors were cloned and validated according to standard methods. SCID or C57BL/6 mice were injected intraperitoneally with these same vectors. Reporter gene expression was evaluated using a luciferase reporter assay and cellular cytotoxicity in vitro was determined using an MTT assay. Acute toxicity was assessed by histologic evaluation of harvested tissues.

RESULTS: Consistent induction of the MK and Cox-2 promoters was noted I each of the ovarian cancer cell lines as well as in primary ovarian cancer cells. In contrast, reduced reporter activity was reported in mesothelial cells transduced with adenoviruses containing the test promoters, which was specially apparent for the cox-2 promoter. The cox-2 promoter exhibited relatively lower levels of reporter activity in the liver and peritoneum than the control promoter in in vivo experiments. Tumor cell killing induced by the AdCox-2M-TK was comparable to the observed with the AdCMV-TK but there was clear differential toxicity pattern in favor of animals treated with AdCox-2-TK compared to controls.

CONCLUSIONS: These data clearly demonstrate that the transcriptional control afforded by the cox-2 promoter allowed a substantial mitigation of gene expression and associated toxicity in normal tissue while maintaining therapeutic efficacy in the context of an ovarian cancer molecular chemotherapy routing schema.

Supported by an IUAC American Cancer Society Beginning Investigators grant.

Comunicación 44

GENE THERAPY OF ORTHOTOPIC HEPATOCELLULAR CARCINOMA IN RATS USING ADENOVIRUS CODING FOR INTERLEUKIN-12 (IL-12)

Miguel Barajas, Guillermo Mazzolini, Guillem Genové, Roberto Bilbao, Iñigo Narvaiza, Volker Schmitz, Bruno Sangro, Ignacio Melero, Cheng Qian and Jesús Prieto

Laboratorio de Terapia Génica del Cáncer. Departamento de Medicina Interna. Universidad de Navarra. Pamplona

BACKGROUND AND AIMS: The use of gene therapy to enhance antitumor immunity has emerged as a promising procedure to fight cancer. In this study we have tested the ability of an adenovirus carrying murine interleukin-12 gene (AdCMVIL-12) to eliminate tumoral lesions in two animal models of orthotopic hepatocellular carcinoma.

MATERIAL AND METHODS: One or two tumors were implanted in the liver by intrahepatic inoculation of hepatocellular carcinoma (HCC) cells McA-RH7777 into the left liver lobe of syngenic Buffalo rats. When tumor nodules reached the size of 1 cm in diameter approximately rats were subjected to intratumoral injection of AdCMVIL-12. Tumor size, survival of animals, immunologic effectors and antiangiogenic effects were assessed in treated and control rats. Serum mouse IL-12 and rat IFN-gamma were determined by enzyme linked immunosorbent assay. Antiangiogenesis was analyzed by studying the vascularization of a Matrigel plug embedded with Vascular Endothelium Growth Factor (VEGF) and implanted into the liver of rats which received either AdCMVIL-12 or control adenoviral vector.

RESULTS: Intratumoral injection of AdCMVIL-12 in animals with a single big tumor nodule implanted in the liver resulted in significant inhibition of tumor growth in a dose-dependent manner. Fifty percent of animals, which received a dose of 5 x 10e9 pfu, showed complete regression of the tumor two weeks after treatment. In animals with two independent tumor nodules in the left liver lobe, injection in only one of them of 5 x 10e9 pfu AdCMVIL-12 induced, 15 days after therapy, complete regression of 50% of treated tumors and also of 50% of untreated lesions, with 60% long-term survival. Rats which were tumor-free after therapy with AdCMVIL-12 showed protection against tumor rechallenge. Thus, we found that tumor-bearing rats treated with AdCMVIL-12 produced IL-12 with maximal values at day 1 and high serum levels of IFN-gamma were detected at all time points after AdCMVIL-12 administration. In contrast, in animals receiving control vector AdCMVlacZ or saline, serum IL-12 and IFN-gamma were undetectable. Activation of NK cells and inhibition of angiogenesis were found to be antitumor mechanisms set in motion by AdCMVIL-12.

CONCLUSION: Experimental hepatocellular carcinoma can be efficiently treated by intratumoral injection of adenovirus expressing IL-12.

Comunicación 45

ESPECIFICIDAD, EFICACIA Y SEGURIDAD DE UN SISTEMA DE PURGADO IN VIVO, PARA LA ELIMINACIÓN DE ENFERMEDAD TUMORAL RESIDUAL EN PRODUCTOS HEMATOLÓGICOS UTILIZADOS EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA

R. Lillo, M. Ramírez, A. Álvarez, J. Fernández de Velasco, S. Santos, M.J.Avilés, J. García-Castro, A. Balas, J.L. Vicario, J.A. Bueren, F. García-Sánchez*.

Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid Avda. Menéndez Pelayo 65. 28009 Madrid

La administración de quimioterapia a altas dosis, seguida de rescate hematológico mediante autotrasplante de progenitores hematopoyéticos de sangre periférica (TASPE), es uno de los procedimientos terapéuticos más utilizados en la actualidad en pacientes afectos de tumores tanto hematológicos como no hematológicos. El principal problema derivado de este tipo de tratamiento, es el papel que la contaminación tumoral residual de los productos utilizados en autotrasplante puede tener en una posterior recaída, al reinfundir al paciente progenitores hematopoyéticos contaminados con población tumoral. Esta contribución ha sido claramente demostrada mediante técnicas de gene marking, tanto en tumores hematológicos como Leucemia Mieloide Crónica (LMC), como en tumores sólidos como Neuroblastoma. En cáncer de mama, no se ha podido establecer todavía una correlación directa entre la reinfusión de células contaminantes y la recaída post-trasplante. Sin embargo, existen evidencias clínicas suficientes para hacer pensar que tienen un comportamiento similar, como lo demuestra el hecho del desarrollo de innumerables técnicas de purgado que incluyen procedimientos inmunológicos, procedimientos quimioterapéuticos y de inmuno-selección entre otros. Sin embargo, todos los procedimientos descritos, o no consiguen una eliminación total de las células tumorales, o producen un daño significativo en la capacidad de injerto de las células progenitoras hematopoyéticas. Con el objetivo de eliminar de forma eficiente, selectiva y segura, las células de cáncer de mama, sin dañar la capacidad de injerto de las células stem hematopoyéticas, hemos diseñado un procedimiento de purga in vivo utilizando un adenovirus recombinante que contiene el gen bacteriano Citosina Deaminasa bajo el control de la región enhancer-promotora del Citomegalovirus , Ad.CMV-CD. El gen CD, codifica para una enzima que es capaz de desaminar específicamente la prodroga no tóxica 5-Fluorocitosina (5FC) a su forma activa tóxica, 5-Fluorouracilo (5FU). Se han determinado in vitro, tanto las condiciones que llevan a la infección del 100% de las células tumorales, mientras las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ no son infectadas; como las concentraciones de 5FC y el tiempo de exposición necesarios para la total eliminación clonogénica in vitro de todas las células tumorales de cáncer de mama, sin que exista daño en la capacidad clonogénica in vitro de los progenitores hematopoyéticos. Una vez determinadas las condiciones experimentales in vitro, se ha desarrollado un modelo híbrido de trasplante ratón-humano con el objeto de imitar, de una forma más precisa, la situación real, en la que las células de cáncer de mama son trasplantadas junto con las hematopoyéticas. Se realizaron mezclas artificiales de células CD34+ contaminadas con un 1% de células tumorales provenientes de la línea tumoral MDA-MB-231. Dichas mezclas artificiales fueron infectadas con el adenovirus recombinante Ad.CMV-CD (Control de Purga) o no infectadas con el vector adenoviral (Control Negativo) y posteriormente trasplantadas a ratones NOD/SCID a los que les fue administrada intraperitonealmente la 5FC. Los resultados del procedimiento realizado en dos ensayos independientes, mostraron una diferencia significativa en la supervivencia entre ambos grupos (100% Control de Purga vs 28% Control Negativo, p<0,012). Los análisis realizados para conocer el grado de prendimiento de la hematopoyesis humana en ambos grupos, demostraron que en ningún momento a lo largo del período que duró el estudio post-trasplante (30-120 días), hubo diferencias, tanto en el número de células CD45+ humanas, como en la composición de dicha celularidad (injerto multilineal) en los distintos órganos analizados (médula ósea y bazo). Los estudios histológicos y de biología molecular realizados, demostraron que todos los ratones trasplantados con mezclas no infectadas con el vector recombinante Ad.CMV-CD (Control Negativo) tenían enfermedad diseminada (Metástasis), mientras que los que recibieron mezclas infectadas con el vector adenoviral Ad.CMV-CD estaban libres de enfermedad histológica y molecular. Estos resultados evidencian la posible utilidad de vectores adenovirales recombinantes para la erradicación de enfermedad residual tumoral existente en productos hematológicos utilizados en pacientes sometidos a altas dosis de quimioterapia más rescate hematopoyético con trasplante autólogo.

Comunicación 46

IMPACTO DE LA TRANSFERENCIA DE LOS GENES SUICIDAS CYP2B1/CPA Y HSVTK/GCV SOBRE UN MODELO DE ADENOCARCINOMA DE PÁNCREAS EXOCRINO HUMANO

Meritxell Carrió, Joana Visa, Anna Cascante, Xavier Estivill, Cristina Fillat

Centre de Genètica Mèdica i Molecular. Institut de Recerca Oncològica. L'Hospitalet de Llobregat. Barcelona.

El adenocarcinoma de páncreas es uno de los tumores más agresivos y representa la cuarta causa de muerte por cáncer en el mundo occidental. Dada su prognosis tan negativa resulta un modelo idóneo para el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas. La transferencia de genes bioactivadores de prodrogas, tambien denominados genes suicidas, es una de las estrategias más prometedoras dirigidas a eliminar las células tumorales. El gen suicida de la timidina quinasa del Virus Herpes (HSVtk) en combinación con la prodroga ganciclovir (GCV) ha dado lugar a resultados muy prometedores en un gran número de células tumorales aunque la eficiencia de dicho sistema es muy variable dependiendo de las características de cada tumor. Nosotros hemos estudiado la efectividad del gen suicida Citocromo P4502B1 (CYP2B1) que utiliza como prodroga la ciclofosfamida (CPA) en células tumorales de páncreas in vitro y en un modelo in vivo desarrollado en el tejido subcutáneo de ratones atímicos. Hemos comparado la eficiencia de dicho sistema con el de HSVtk/GCV y se ha valorado el efecto citotóxico de la combinación de ambos. Hemos observado que la transducción de las líneas tumorales, NP-9, NP-18 y NP-31 con el retrovirus que expresa el gen CYP2B1 y posterior tratamiento con CPA da lugar a un porcentaje de muerte celular similar en cada tipo celular. Dichas células disponen además de un potente efecto adyacente. La combinación del sistema HSVtk/GCV con CYP2B1/CPA in vitro en células NP-18 da lugar a una potenciación del efecto citotóxico. Los experimentos realizados en el modelo in vivo demuestran una reducción en la progresión tumoral en las tres estrategias estudiadas; HSVtk/GCV, CYP2B1/CPA y la combinación de ambos, con una mayor eficacia de muerte celular por parte del sistema HSVtk/GCV.

Comunicación 47

DEMOSTRACIÓN DE SINERGIA IN VITRO ENTRE VECTORES ADENOVIRALES RECOMBINANTES PRODUCTORES DE INTERFERON g O FACTOR DE NECROSIS TUMORAL a Y AGENTES QUIMIOTERÁPICOS.

I.García Ribas, RM. Díaz, RG Vile, IR Hart. Richard Dimbleby.

Departament of Cancer Research/ICRF Unit. St Thomas Hospital. Londres. RU.

MATERIALES Y MÉTODOS: Hemos utilizado tres adenovirus recombinantes basados en el adenovirus tipo 2 (Ad2). (a) Ad2IFN-g expresa interferón-g. (b) Ad2TNF-a expresa el factor de necrosis tumoral a. (c) Ad2HSVtk expresa el enzima timidina kinasa del virus Herpes Simplex tipo I que es capaz de metabolizar en la ganciclovir a ganciclovir monofosfato que actúa como un fármaco citotóxico. Los experimentos se han realizado in vitro utilizando una modificación del ensayo de screening de fármacos citototóxicos del National Cancer Institute (NCI).Este ensayo es un método colorimétrico de supervivencia celular que se realiza en placas de 96 pocillos. En ellos se coloca una cantidad fija de células en cultivo. Cada uno de los agentes se aplica en las filas o columnas para formar una matriz con las combinaciones de ambos. La citotoxicidad de cada combinación se analiza mediante un programa informático que calcula los valores de sinergia o antagonismo y sus intervalos de confianza en función de la supervivencia celular tras un periodo fijo de incubación de 5 días. La línea celular sobre la que se han ensayado las distintas combinaciones de virus y/o fármacos es la línea humana de carcinoma ovárico OVCAR-3.

RESULTADOS: Hemos demostrado y cuantificado la sinergia entre el sistema HSVtk/GCV y las citokinas TNF-a e IFN-g. Esta sinergia se ha demostrado cuando las citokinas se expresan utilizando los virus recombinantes como cuando se añaden exógenamente como proteína recombinante. Asimismo aparece sinergia en sistema libre de virus cuando se utiliza la línea celular OVCAR-3TK que expresa de modo estable el gen HSVtk.

Con este mismo sistema experimental hemos podido demostrar la existencia de antagonismo citotóxico cuando se combina el sistema HSVtk/GCV con cisplatino o paclitaxel.

CONCLUSIONES:

1. Es posible construir adenovirus recombinantes que expresen de modo constitutivo TNF-a o IFN-g humanos a pesar de su efecto citotóxico.

2. El ensayo in vitro de sinergia entre fármacos del NCI es válido para cuantificar sinergia y antagonismo utilizando vectores virales de terapia génica y puede ser utilizado como sistema rápido de muestreo para estas combinaciones.

3. El sistema HSVtk/GCV es sinérgico con las citokinas IFN-g o TNF-a sobre la línea OVCAR-3.

El sistema HSVtk/GCV y los quimioterápicos paclitaxel y cisplatino son antagónicos en su efecto tóxico sobre la línea de cáncer de ovario OVCAR-3.

Comunicación 48

GENETIC HETEROGENEITY IN THE TOXICITY TO SYSTEMIC ADENOVIRAL GENE TRANSFER OF INTERLEUKIN-12.

Guillermo Mazzolini, Iñigo Narvaiza, Ainhoa Pérez-Diez, Mercedes Rodriguez-Calvillo, Cheng Qian, Bruno Sangro, Juan Ruiz, Jesús Prieto and Ignacio Melero

Unidad de Terapia Génica. Dpto. Medicina Interna. Universidad de Navarra.

Despite the efficacy of IL-12 in cancer experimental models, clinical trials with systemic recombinant IL-12 showed unacceptable toxicity related to endogenous IFNg production. We report that systemic administration of a recombinant adenovirus encoding IL-12 (AdCMVmIL-12) has a dramatically different survival outcome in a number of mouse pure strains over a wide range of doses. For instance at 2.5 x 109 pfu, systemic AdCMVmIL-12 killed all C57BL/6 mice but spared all BALB/c mice. Much higher IFNg concentrations in serum samples of C57BL/6 than in those from identically treated BALB/c were found. Causes for heterogeneous toxicity can be traced to differences among murine strains in the levels of gene transduction achieved in the liver, as assessed with adenovirus coding for reporter genes. In accordance, IL-12 serum concentrations are higher in susceptible mice. In addition, sera from C57BL/6 mice treated with AdCMVmIL-12 showed higher levels of IL-18, a well-known IFNg inducer. Interestingly, lethal toxicity in C57BL/6 mice was abolished by administration of blocking anti IFNg mAbs and also by simultaneous depletion of T-cells, NK-cells, and macrophages.
These observations together with the great dispersion of IFNg produced by human PBMCs upon in vitro stimulation with IL-12, or infection with recombinant adenovirus encoding IL-12, suggest that patients might also show heterogeneous degrees of toxicity in response to IL-12-gene transfer.

Comunicación 49

UN MODELO MURINO PARA EL PURGADO DE MÉDULA ÓSEA CONTAMINADA CON LEUCÉMIA MIELOMONOCÍTICA UTILIZANDO VECTORES ADENOVIRALES .

Javier García-Castro^a, Paula Río^a, José C. Segovia^a, Rosa Lillo^c, Félix García-Sánchez^c, Jesús Gómez-Navarro^b, David T. Curiel^b, Juan A. Bueren^a.

^a Programa de Terapia Génica. CIEMAT/Fundación Marcelino Botín. Madrid. ^b Division of Human Gene Therapy, Departments of Medicine, Pathology and Surgery, and Gene Therapy Center, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, EEUU. ^cCentro de Transfusión de la Comunidad de Madrid.

El trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos (PH) constituye una de las aproximaciones terapéuticas para pacientes con leucemia mieliode aguda (LMA). No obstante, una de las limitaciones asociadas a esta estrategia proviene de la posibilidad de que las células leucémicas contaminen la muestra a trasplantar, y por tanto contribuyan a la recaída de estos pacientes. Actualmente existen diversos métodos para purgar inóculos contaminados con leucemia, aunque, en general, suelen ser poco selectivos por lo que también producen un daño severo a los PHs. Con el objetivo de estudiar nuevas aproximaciones para faciliar el purgado selectivo y eficaz de esos inóculos, hemos evaluado la susceptibilidad de células leucémicas mielomonocíticas del ratón (Wehi-3B) y de células sanas de la médula ósea (MO) frente a vectores adenovirales. Mediante la utilización de vectores adenovirales de primera generación (Reg-Ads) se consiguió transducir hasta el 100% de las células Wehi-3B utilizando MOIs de 100 y tiempos de infección de 8 horas. En estas condiciones sólo un 20-30% de las células de MO fueron transducidas con los Reg-Ads. Utilizando adenovirus con tropismo modificado (RGD-Ads) obtuvimos también un 100% de transducción de las células WEHI-3B, si bien, en este caso sólo fueron necesarios 10 minutos de incubación con el vector. Bajo estas condiciones, tan sólo un 15-20% de las células de MO fueron transducidas. Utilizando Reg-Ads que expresaban el gen suicida Citosina Deaminasa (AdCD) conseguimos eliminar el potencial clonogénico de las células leucémicas cuando se añadía la prodroga 5-fluorocitosina (5-FC) al cultivo. Asimismo, en un modelo in vivo de recidiva leucémica post-trasplante observamos que la transducción adenoviral de MO contaminada con WEHI-3B, seguido del tratamiento in vivo con 5-FC prevenía la recaída leucémica de la mayor parte de los animales, mientras que todos los receptores cuyo inóculo no fue sometido a este proceso de purga murieron por el desarrollo de LMA.

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INCREMENTO DE LA SENSIBILIDAD AL FÁRMACO 5-FLUOROURACILO (5-FU) MEDIADO POR LA TRANSDUCCIÓN ADENOVIRAL DE ENZIMAS CATALIZADORAS DE LA SÍNTESIS DE PIRIMIDINAS EN CÁNCER DE MAMA .

Álvarez-Doval A ¹, Lillo R¹, Fernández de Velasco J¹, Santos S¹, Avilés MJ¹, Balas A¹, Vicario JL1, Pizorno G², García-Sánchez F¹.

1-. Laboratorio de Histocompatibilidad y Biología Molecular. Centro de Transfusión de Madrid. 2-. Medical Oncology. Yale University School of Medicine. New Haven, CT. (USA).

El agente antineoplásico 5-Fluorouracilo (5-FU), es un conocido agente anti-tumoral que se emplea de forma rutinaria en el tratamiento de tumores sólidos como el cáncer de mama. Para la producción de su efecto citotóxico, el 5-FU debe ser activado enzimáticamente, ejerciendo su actividad a tres niveles fundamentales; i.) incorporación como 5-fluorouridina trifosfato (5-FUTP) a nivel del RNA, ii.) incorporación como 5-deoxifluorouridina trifosfato (5-FdUTP) a nivel de DNA y iii.) produciendo la inhibición de la enzima Timidilato Sintetasa (TS) por 5-deoxifluorouracilo monofosfato (5-dFUMP). Basándonos en el conocimiento de las rutas bioquímicas de activación del 5-FU, hemos diseñado un sistema adenoviral capaz de favorecer la sensibilización al 5-FU en diferentes líneas celulares de cáncer de mama. Para ello, hemos generado dos vectores adenovirales, ambos bajo el control de la región enhancer/promotora del citomegalovirus (CMV), conteniendo el gen eucariótico! Uracilo Monofosfato Sintasa (UMPase), una enzima que participa en la ruta de síntesis de los nucleótidos de pirimidina, (Ad.CMV-UMPs) o su gen homólogo procariótico, Uracilo fosforribosil transferasa (UPRTasa) (Ad.CMV-UPRTasa). Los resultados obtenidos en nuestro estudio muestran, que la transducción adenoviral conteniendo los genes activadores del 5-FU produce una sobreexpresión de las enzimas activadoras en todas las líneas tumorales estudiadas, conllevando dicha sobreexpresión a un importante incremento de la sensibilización al agente 5-FU, reflejado específicamente tanto en la reducción del porcentaje de supervivencia como en la reducción de la Concentración de Inhibición al 50% (IC50). Estos datos se han visto corroborados por estudios farmacológicos, donde se ha observado una mayor producción intracelular de los metabolitos activos del 5-FU, así como una mayor incorporación de dichos metabolitos tanto a nivel de DNA como de RNA. Estos estudios proponen una nueva aproximación de la terapia génica como adyuvante en la quimiosensibilización a diferentes agentes farmacológicos utilizados en el tratamiento de diversos tumores sólidos.

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EVALUACION PRECLÍNICA DEL PROMOTOR DE L-PLASTIN PARA DIRIGIR TRANSCRIPCIONALMENTE LA TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR ADENOVIRUS A TUMORES OVÁRICOS

E. Casado, J. Gómez-Navarro, K. Suzuki, W. Arafat, M. Wang, S.D Barker, J. De Castro, E. Espinosa, P. Zamora, J. Feliu, A. Ordonez, M. González Barón, DT Curiel.
Servicio de Oncología Médica, Hospital La Paz Paseo de la Castellana, 261, Madrid 28046

OBJETIVO: El promotor de L-Plastin (LPp) se halla preferentemente activado en tumores ováricos. Nuestro objetivo fue determinar su potencial utilidad para el direccionamiento (targeting) transcripcional de vectores adenovirales recombinantes en el contexto de cáncer de ovario (CAOV), empleando modelos, in vitro e in vivo, clínicamente relevantes.

METODOS: Las lineas celulares de CAOV OV4, SKOV3.ip1, OVCAR3, PA-1, y SW626 fueron exploradas. Ademas, celulas primarias de adenocarcinomas ovaricos fueron aisladas y purificadas de la ascitis de cinco pacientes por procedimientos inmunomagnéticos desarrollados en nuestro laboratorio. Células mesoteliales fueron obtenidas comercialmente y purificas de muestras clínicas obtenidas de mesotelios normales. Los mencionados sustratos celulares fueron infectados con AdLP-LacZ y AdCMV-LacZ, 72 h después la expression de b-gal fue cuantificada por el metodo de FACS-FDG. Las muestras de mesotelio fueron infectadas en similares condiciones, pero la expresión se valoró por tinción de X-gal. Finalmente, ratones SCID fueron inyectados intraperitonealmente con 109 u.f.p (unidades formadoras de placa) de AdLP-LacZ o AdCMV-LacZ, y la tinción de X-gal de la cavidad abdominal fue realizada al cabo de 72 horas.

RESULTADOS: Las muestras de celulas de CAOV y mesoteliales alcanzaron una pureza superior al 90% . En lineas celulares el % de células expresando b-gal fue el siguiente, para LP y CMV: OV4: 12 y 86%, OVCAR3: 46 y 68%, SKOV3.ip1: 26 y 72%, y PA-1: 34 y 56%, respectivamente. Datos análogos se obtuvieron de celulas humanas purificadas de CAOV y mesotelio, y los ratios (% + con LPp / % + con CMVp) variaron desde 0.24 a 0.7 en el tumor, y desde 0.1 a 0.6 en el mesotelio. Un índice terapéutico, establecido como la relacion entre el porcentaje medio de células expresando b-gal en el tumor y en el mesotelio, fue de 0.21 for LP y 0.23 para CMV. In vivo, la cavidad abdominal fue minimamente teñida con AdLP-LacZ.

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UN ADENOVIRUS REPLICATIVO CONDICIONAL CON INFECTIVIDAD AUMENTADA (AdD24-RGD) PARA LA TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER DE OVARIO: EVALUACION PRECLÍNICA DE SELECTIVIDAD, POTENCIA ONCOLÍTICA Y ESTRATEGIAS DE COMBINACIÓN CON QUIMIOTERAPIA.

E. Casado, R. Alemany, J. Gómez Navarro, K. Suzuki, C. Balague, W. Arafat, MA González, B. Tabarés, P. Ceja, M. González Barón, DT Curiel.

Servicio de Oncología Médica, Hospital La Paz. Madrid.

La combinación de Adenovirus Replicativos Condicionales (CRAds) con quimioterapia ha mostrado recientemente su potencial utilidad para el tratamiento del cáncer en el contexto de los ensayos clínicos. Sin embargo, existe una importante falta de información respecto las posibles interacciones de la replicación viral y las interacciones con la quimioterapia. Además, replicación selectiva, potencia oncolítica y aumento de la infectividad son aspectos cruciales para lograr índices terapéuticos. Hemos previamente demostrado una mayor eficiencia en la transducción de cancer de ovario (CAOV) con un adenovirus modificado con un motivo RGD en la fibra del adenovirus (AdD24-RGD). Con estas consideraciones hemos evaluado la potencial utilidad de el CR Ad D24-RGD para la terapia génica del CAOV, y como modelo para la terapia de combinacion. El vector parental AdD24 replica sólo en células donde la ruta de Rb (Rb/p16/CDK4/CyclinD1) se encuentra alterada, como sucede en la mayoría de los CAOVs. Para determinar la replicación selectiva medimos la producción viral en lineas celulares de CAOV OV4, SKOV3.ip1, PA-1, y OVCAR3 , y en células primarias. El titulo diferencial fue realizado por un test de proteina BCA y espectrofotometría. Los cocientes obtenidos (tumor/mesotelio), variaron desde 1.3 a 2.6´ 104, indicando, por tanto, una replicación preferencial en el tumor. La potencia oncolítica fue demostrada por los tests de citotoxicidad MTT y el de proteina BCA, comparando con el vector no replicativo AdGFP-RGD, en lineas celulares de CAOV y en celulas primarias de CAOV purificadas de las ascitis de pacientes, por un metodo inmunomagnético desarrollado en nuetro laboratorio. A continuacion exploramos el efecto oncolítico logrado en celulas SKOV3.ip1 y en tumores portadores de tumores ováricos establecidos, con AdD24-RGD en monoterapia, o en combinación con taxol, o cisplatino, en adminstración concomitante o secuencial con el AdD24RGD. Eficacia antitumoral fue demostrada in vitro e in vivo, a pesar de que no se observó quimiosensibilización. La administración de el CRAd con anterioridad a la quimioterapia no mejoró los resultados. Por tanto, AdD24-RGD exhibe un aumento en la infectividad, replicación selectiva y potencia oncolítica en un modelo de CAOV. Sin embargo, nuestros datos no sugieren quimiosensibilización, y un efecto antagónico no puede ser excluido.

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INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS IN VITRO MEDIANTE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 1B5 MICROENCAPSULADAS Y SECRETORAS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI CADERINA-VE

Orive G.¹, Hernández R.M.¹, Gascón A.R.¹, Igartua M.¹, Rojas A.², Pedraz J.L.¹

¹Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad del País Vasco, Vitoria-Gasteiz. ²Centro de Química Farmacéutica, La Habana, Cuba.

Los tumores sólidos requieren de la angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos), que ellos mismos inducen, para crecer y metastatizar. Teniendo esto en cuenta, existe un gran interés en el empleo de antiangiogénicos para inhibir la expansión tumoral. Numerosos estudios demuestran que la caderina del endotelio vascular o caderina-VE (una proteína citoadhesiva específica del componente vascular) está implicada en procesos de inflamación, proliferación celular y angiogénesis tumoral. De hecho, el empleo de anticuerpos monoclonales contra la caderina-VE se traduce en la inhibición de la adhesión entre células endoteliales y la interrupción en la formación de microtúbulos (preámbulo de los futuros vasos sanguíneos).

Este trabajo supone una nueva aproximación a la inhibición de la angiogénesis tumoral mediante la inmovilización de células de hibridoma 1B5 productoras de anticuerpos monoclonales anti caderina-VE en microcápsulas de alginato-agarosa. La membrana semipermeable de la microcápsula permite el flujo bidireccional de oxígeno, nutrientes, desechos y productos celulares pero protege a las células de hibridoma del ambiente hostil externo.

Las células de hibridoma crecieron en el interior de las microcápsulas generando agregados de tamaño variable. La viabilidad de las células alcanzó una absorbancia máxima de 0,0035 por microcápsula en el día dos de cultivo, observándose un descenso y una posterior recuperación de la actividad celular en los hibridomas inmovilizados. Por otra parte las células de hibridoma microencapsuladas secretaron anticuerpo anti caderina-VE durante los 9 días de estudio, logrando una concentración acumulada total de 1,7 µg/mL. Esta concentración de anticuerpo inhibió en un 87,8% la formación de microtúbulos (última etapa de la angiogénesis) en un ensayo de angiogénesis in vitro de Matrigel.

Estos resultados suponen una nueva alternativa a la prevención o inhibición de la angiogénesis y demuestran la posibilidad de emplear la microencapsulación celular como sistema de liberación controlada.

Comunicación 54

UTILIZACIÓN DE LA INTERLEUQUINA 12 COMO ADYUVANTE EN LA INMUNIZACIÓN GÉNICA CON ANTÍGENO DEL CORE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS DE LA MARMOTA (WHV): INDUCCIÓN DE RESPUESTA CELULAR TH1 Y PROTECCIÓN FRENTE A LA INFECCION EXPERIMENTAL CON WHV.

R. García, B. Blanco Urgoiti, A. Vales, P.Berraibdi, R. Sánchez de la Rosa, J.J. Lasarte, S. Hervás-Stubbs, F. Borrás-Cuesta, J. Ruiz y J. Prieto.

División de Terapia Génica y Hepatología. Departamento de Medicina Interna. Facultad de Medicina. Universidad de Navarra. Pamplona.

INTRODUCCION: La infección en Marmota monax por el virus de la hepatitis B de la marmota (WHV) es el modelo animal que mejor reproduce las características de la infección por el VHB en el hombre. Utilizando la pistola génica, hemos inmunizado marmotas con un plásmido (pCw) que expresa el antígeno del core del WHV ( WHcAg), sólo o en combinación con otro plásmido que codifica para la interleuquina 12 de marmota (pIL12mar), citoquina que favorece un perfil de respuesta Th1. Hemos estudiado en estos animales la respuesta inmunitaria humoral y celular inducida frente al antígeno del core, y la modulación de esta respuesta al coinmunizar con pIL12mar. Finalmente, hemos estudiado en marmotas el efecto protector frente a la infección con un inóculo viral de cada una de las estrategias de vacunación génica propuestas.

METODOS: Se utilizaron un total de 11 marmotas sanas. Cuatro marmotas recibieron una dosis de 8 μg de pCw divididas en 4 disparos en distintos puntos de la piel abdominal y cinco animales recibieron la misma dosis de pCw más 8 μg de pIL12mar (esta última superpuestas sobre el plásmido pCw). Se llevaron a cabo tres rondas de inmunización, separadas por intervalos de dos semanas. Como control de la infección se utilizaron dos marmotas sanas. Todos los animales fueron inyectados subcutáneamente con un inóculo viral conteniendo 10¹⁰ partículas genómicas de WHV y se realizó un seguimiento semanal de los animales durante un periodo de 10 semanas, estudiándose parámetros virológicos, serológicos e inmunológicos.

RESULTADOS: Todos los animales inmunizados, tanto con pCw sólo como con pCw + pIL12mar, desarrollaron respuesta celular específica frente al a WHcAg y 7/9 presentaron títulos de anti-WHcAg en un rango de 1/90 a 1/400. Después de la inoculación con WHV, los 5 animales inmunizados con pCw + pIL12mar resultaron protegidos de la infección (WHV-DNA negativo en suero durante el seguimiento), y mostraron respuesta celular frente al WHcAg, caracterizada por una alta producción de IFN-a (perfil Th1). Sorprendentemente, ¾ animales inmunizados con pCw no resultaron protejidos, presentando niveles de viremia incluso más altos y prolongados que los animales control, junto con baja producción de IFN-a (perfil Th2).

CONCLUSIONES: La inmunización mediante pistola génica frente al WHcAg ( antígeno interno que no es capaz de inducir anticuerppos neutralizantes frente al virus) puede generar una respuesta inmune celular con perfil Th2, ineficaz e incluso perjudicial en la protección de los animales frente a la infección por WHV. Esta situación puede ser completamente revertida mediante la coinmunización con citoquinas de tipo Th1 (IL12mar).

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DISEñO Y DESARROLLO DE UNA ESTRATEGIA DE TERAPIA GENICA ANTIVIRAL FRENTE AL VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB)

P. Berraondo, R. García, A. Vales, G. Kramer, , JI. Riezu-Boj, E. Larrea, J. Ruiz y J. Prieto.

División de Terapia Génica y Hepatología. Departamento de Medicina Interna. Facultad de Medicina. Universidad de Navarra. Pamplona.

La infección crónica por el VHB afecta a más de 200 millones de personas en todo el mundo y da lugar a hepatitis crónica, cirrosis y cáncer de hígado. El tratamiento actual se limita al uso de interferón-alfa (IFN-a) recombinante y lamivudina, pero la eficacia global es baja. La modificación de la farmacocinética del IFN-a al unirle covalentemente polietilenglicol ha permitido aumentar la tasa de respuesta en pacientes con infección por el virus de la hepatitis C y se está ensayando en la infección por VHB. Tomando como modelo la infección por este virus, describimos los pasos necesarios para el diseño de una estrategia de terapia génica frente a una infección viral.

Modelo animal de estudio: utilizamos la Marmota monax infectada por el virus de la hepatitis de la marmota (WHV), un virus perteneciente a la misma familia que el VHB (hepadnavirus), con el que comparte características genéticas, estructurales, biológicas, clínicas y de respuesta ante distintos fármacos.

Preparación del gen terapéutico: utilizando una biblioteca de cDNA obtenida de células mononucleares de marmota estimuladas con poli-I/poli-C (estímulo específico de IFN-a), hemos clonado en primera instancia dos subtipos de IFN-a y con cebadores obtenidos a partir de dichas secuencias y usando DNA genómico hemos aislado otros 3 subtipos más. Los genes de los distintos subtipos de IFN-a aislados se han clonado en un plásmido de expresión en eucariotas bajo el control del promotor del CMV y se ha comprobado su actividad biológica in vitro mediante la cuantificación por PCR cuantitativa de la 2-5 oligoadenilato sintetasa y la inhibición del promotor de SV40 en células de hígado de marmota (células WCH17).

Modificación del cassette de expresión: con objeto de optimizar la expresión de los genes de interferón, se han eliminado del extremo 3 de estos genes los motivos AUUUA que desestabilizan el mRNA y se han sustituído por el elemento regulatorio post-transcripcional del WHV. Este elemento, clonado por PCR a partir de suero de una marmota con infección crónica por WHV, aumenta la expresión del transgen y su efecto se ha comprobado tanto en una construcción con el gen reportero luciferasa como con los distintos genes de IFN-a.

Elección del vector: como vector para conseguir una expresión prolongada del gen del IFN-a en el hígado de las marmotas hemos escogido los virus adenoasociados (AAV) por su escasa inmunogenicidad y su capacidad de integrar el gen terapéutico en el genoma de las células infectadas. Con objeto de determinar la dosis de AAV y el posible efecto de la infección por WHV, hemos introducido dichos virus por vía intrahepática en dos marmotas, una sana y otra crónica, y estudiado la persistencia de la expresión dos meses después. Finalizada la clonación del gen del IFN-a en el AAV se procederá a su administración en animales con infección crónica para estudiar su efecto antiviral.

LISTA DE PARTICIPANTES

Apellidos	Nombre	Sesión	P/CO	Nº	Dirección correo	Dirección
Sánchez González	Humberto	Vectores	C.O	1	hsanchez@cbm.uam.es	Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" CSIC-UAM. Campus Cantoblanco. Madrid-28049
Chillon	Miguel	Vectores	C.O	2	Miguel.Chillon@uab.es	Dpto Bioquímica y Biologia Molecular. F. Veterinaria. Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG). Univ. Barcelona. Barcelona-08193
Segovia Sanz	Jose C	Vectores	C.O	3	segovia@ciemat.es	Avda. Complutense, 22 Ed 7. CIEMAT. Madrid-28040
Guenechea Amurrio	Guillermo	Vectores	C.O	4	g.guenetxea@ciemat.es	CIEMAT, Programa de Biología Molecular y Celular y Terapia Génica. Edificio 7, Av. Complutense 22. Madrid-28040
Guillem Primo	Vicent	Vectores	C.O	5	Vicente.Guillem@uv.es	Dpto. Farmacología. Facultad de Medicina. Avda. Blasco Ibañez, 15. Valencia-46010
Osta Pinzolas	Rosario	Vectores	C.O	6	osta@posta.unizar.es	Dpto Anatonia, Embriología y Génetica Animal. Fac. Veterinaria. Unv Zaragoza.C/ Miguel Servet, 177. Zaragoza-50013
Tros de Ilarduya Apaolaza	María Concepción	Vectores	C.O	7	ctros@unav.es	Centro Galénico.Dpto de Farmacia y Tec. Farmacéutica.Universidad de Navarra. Apartado 177. Pamplona-31080
Vera	M.	Vectores	P	8	mveruga@alumni.unav.es	Dpto Medicina Interna, Universidad de Navarra. C/Irunlarrea s/n. Pamplona-31080
Martín Molina	Francisco	Vectores	P	9	f.martin-molina@ucl.ac.uk	Dep of Immunology, Unv. College. London, 46 Cleveland . Londres WIP 6 DB, UK
Arangoa Ortega	Miguel A.	Vectores	P	10	marangoa@unav.es	Dpto de Farmacología. Fac. Farmacia. Universidad de Navarra. C/Irunlarrea s/n. Pamplona-31080
Moret Tatay	Inés	Vectores	P	11	Ines.Moret@uv.es	Dpto. Farmacología. Facultad de Medicina. Avda. Blasco Ibañez, 15. Valencia-46010
Barquinero Mañez	Jordi	Vectores	P	12	jbarquinero@iro.es	Dpt. Terapia celular. IRO. Gran vía Km 2.7. L´Hospitalet. Barcelona-08907
Lamana Luzuriaga	Maruja	Tj.Somaticos	P	13	lamana@ciemat.es	CIEMAT. Avda Complutense 22. Madrid-28040
Serrano Gómez	Fernando	Tj.Somaticos	P	14	fserrano@cnb.uam.es	Department of Immunology and Oncology. Lab 412. Centro Nacional de Biotecnologia Universidad Autonoma de Cantoblanco. Madrid-28049
Muñoz Alegre	Marta	Tj.Somaticos	P	15	marcela.delrio@ciemat.es	CIEMA. Avda Complutense, 22. Madrid-28040
Larcher Laguzzi	Fernando	Tj.Somaticos	P	16	Larcher@ciemat.es	CIEMAT. Avda. Complutense, 22. Madrid-28040
Garcia Martín	Carmen	Metabólicas	C.O	17	garciamartinca@hotmail.com	Unitat de Recerca. Centre de Transfusió i Banc de Teixits. Passeig Vall d´Hebron 119-129. Barcelona-08035
Benet Giménez	Marta	Metabólicas	C.O	18	Marta.Benet@uv.es	Dpto. Farmacología. Facultad de Medicina. Avda. Blasco Ibañez, 15. Valencia-46010
Mas	Alex	Metabólicas	C.O	19	akemas@mixmail.com	Dpto Bioquímica y Biologia Molecular. UAB. Bellaterra. Barcelona-08193
Ontiveros González	María	Metabólicas	C.O	20	Maria.Ontiveros@uab.es	Dpto Bioquímica y Biologia Molecular. F. Veterinaria. UAB. Bellaterra. Barcelona-08193
Del Río Nechaevsky	Marcela	Metabólicas	C.O	21	Delri@ciemat.es	CIEMAT. Avda. Complutense, 22. Madrid-28040
Ferrer	Aurora	Metabólicas	P	22	a.ferrer@ic.ac.uk	Gene targeting Unit , Imperial College, School of Medicine. Chaning Cross Hospital. ST. Dunstan´s Road. Londres W6 8RP, UK.
Aran	Josep	Metabólicas	P	23	jaran@iro.es	Centre de Genètica Mèdica i Molecular-IRO. Hospital Duran i Reynals. Autovia de Castelldefels Km 2,7. Barcelona-08907
de Semir Frappart	David	Metabólicas	P	24	ddesemir@iro.es	Centro de Genética médica y molecular del Instituto de Recerca Oncológica. Hospital Duran y Reynals. Avda. Castelldefels km 2,7. L´Hospitalet. Barcelona-08907
Casado Olea	Jose A.	Metabólicas	P	25	jose.casado@CIEMAT.es	Avda. Complutense, 22 Ed 7. CIEMAT. Madrid-28040
Rio Galdo	Paula	Metabólicas	P	26	paula.rio@ciemat.es	Avda. Complutense, 22 Ed 7. CIEMAT. Madrid-28040
Ayuso López	Eduard	Metabólicas	P	28	akemas@yahoo.com	Dpto Bioquímica y Biolog. Molecular. Fac. Veterinaria, Edifici V. UAB. Bellaterra. Barcelona-08193
Hidalgo Barrera	Antonio	Metabólicas	P	29	antonio.hidalgo@campus.uab.es	Dpto. Bioq. Y Biología Molecular. Fac. Veterinaria. UAB. Bellaterra. Barcelona-08193
Riu	Efren	Metabólicas	P	30	ivvba@blues.uab.es	Dpto Bioquímica y Biologia Molecular. UAB. Bellaterra. Barcelona-08193
Eritja	Ramon	Silenciamiento Génico	C.O	32	recgma@cid.csic.es	Centro de Investigación y Desarrollo. CSIC Jordi Girona 18-26. Barcelona-08034
Ciudad Gómez	Carlos	Silenciamiento Génico	C.O	33	cciudad@farmacia.far.ub.es	Dpto Bioq. Facultad de Farmacia. Universidad de Barcelona. Avda. Diagonal 643. Barcelona-08028
Rodríguez-García	A.	Silenciamiento Génico	C.O	34	ARG@www-micro.usal.es	Institut de Biología Molecular y Celular del Cáncer. CSIC. Universidad de Salamanca. Campus Unamuno s/n. Salamanca-37007.
Berzal Herranz	Alfredo	Silenciamiento Génico	C.O	35	Alba@ipb.csic.es	Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC. C/Ventanilla, 11. Granada-18001
Abad Minguez	Jose Luis	Silenciamiento Génico	C.O	36	jlabad@cnb.uam.es	CSIC. CNB, Campus de la Universidad Autónoma de Madrid. Cantoblanco. Madrid-28049
Nadal	Anna	Silenciamiento Génico	C.O	37	anadal@hg.vhevron.es	Dpto. Medicina Interna-Hepatología, Hospital Vall d´Hebrón. Passeig Vall d´Hebron 119-129. Barcelona-08035.
Rabanal	Manuel	Silenciamiento Génico	P	38	rabanal@farmacia.far.ub.es	Dpto Fisiología-Divisió IV. Facultad de Farmacia. Universidad de Barcelona. Avda. Diagonal 643. Barcelona-08028
Barroso del Jesus	Alicia	Silenciamiento Génico	P	39	abarroso@ipb.csic.es	Inst.de Parasitología y Biomedicina "López Neyra", (CSIC). Ventanilla 11. Granada-18001
Narvaiza Cuervas-Mons	Iñigo	Cáncer	C.O	40	inarcue@unav.es	Unidad de Terapia Génica. Dpto Medicina Interna, Universidad de Navarra. C/Irunlarrea s/n.Pamplona-31080
Cascalló Piqueras	Manel	Cáncer	C.O	42	cpanc@bq.ub.es	Dpto Bioq. y Biol. Molec. Universidad de Barcelona. C/Martí i Franqués,1. Barcelona-08028
García Ribas	Ignacio	Cáncer	C.O	47	ribas@ctv.es	Hospital Arquitecto Marcide. Carretera a Catabois s/n. Ferrol-15045
Casado Sáenz	Enrique	Cáncer	C.O P P	43,51,52	enriquecasado@jazfree.com	Servicio de Oncología Médica. Hospital La Paz. Paseo de la Castellana, 261. Madrid-28046.
Barajas	Miguel	Cáncer	C.O	44	mbarajas@unav.es	Dpto Medicina Interna, Universidad de Navarra. C/Irunlarrea s/n. Pamplona-31080
Lillo Rodriguez	Rosa María	Cáncer	C.O	45	ctm@bitmailer.net	Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. Avda. Menéndez Pelayo 65. Madrid-28009
Mazzolini Rizzo	Guillermo	Cáncer	P	48	gmazzolini@unav.es	Clínica Universitaria de Navarra. Unidad de Hepatología y Terapia Génica. Avda. Pio XI s/n. Pamplona-31080
García Castro	Javier	Cáncer	P	49	jgcastro@ciemat.es	CIEMAT. Avda. Complutense, 22. Madrid-28040
Álvarez Doval	Ángela	Cáncer	P	50	ctm@bitmailer.net	Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. Avda. Menéndez Pelayo 65. Madrid-28009
Orive Arroyo	Gorka	Cáncer	P	53	knborarg@vc.ehu.es	Dpto de Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Paseo de la Universidad, 7. Vitoria-01006
Garcia Navarro	Raquel	Cáncer	P	54	ragarcia@unav.es	Lab. Medicina Interna. F. Medicina. Universidad de Navarra. C/Irunlarrea 1. Pamplona-31080
Berraondo López	Pedro	Cáncer	P	55	pberlop@alumni.unav.es	Dpto Medicina Interna. Fac. Medicina. Universidad de Navarra. C/Irunlarrea s/n. Pamplona-31080
Municio Escurín	Maria del Mar	Cáncer	P	56	Maria_del_mar_municio@sgsgroup.com	Monitora Ensayos Clínicos.Centro de Investigación y Bioestadística (CIBEST).Avda de Burgos,9. Madrid-28036
Bosch	Fátima	Metabólicas	P P	27, 31	fatima.bosch@uab.es	Dpto Bioquímica y Biologia Molecular. F. Veterinaria. UAB. Bellaterra. Barcelona-08193
Fillat Fonts	Cristina	Cáncer	C.O P	41, 46	cfillat@iro.es	Centre de Genètica Mèdica i Molecular-IRO. Hospital Duran i Reynals. Autovia de Castelldefels Km 2,7. L´Hospitalet. Barcelona-08907

ÍNDICE DE PÓSTERS

Nº	P/CO	Apellidos	Nombre	Título	Sesión
36	C.O	Abad Minguez	Jose Luis	INACTIVACION FUNCIONAL DE CCR5 MEDIANTE TRANSFERENCIA GENICA RETROVIRAL	Silenciamiento Génico
50	P	Álvarez Doval	Ángela	INCREMENTO DE LA SENSIBILIDAD AL FÁRMACO 5-FLUOROURACILO (5-FU) MEDIADO POR LA TRANSDUCCIÓN ADENOVIRAL DE ENZIMAS CATALIZADORAS DE LA SÍNTESIS DE PIRIMIDINAS EN CÁNCER DE MAMA	Cáncer
23	P	Aran	Josep	TRANSFERENCIA DEL GEN WASP MEDIANTE VECTORES RETROVÍRICOS A CÉLULAS B DE PACIENTES CON SÍNDROME DE WISKOTT-ALDRICH	Metabólicas
10	P	Arangoa Ortega	Miguel A.	ASIALOFETUIN-LIPOPLEXES FOR ENHANCED TRANSFECTION OF HEPATIC CELLS	Vectores
28	P	Ayuso López	Eduard	RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESAN IFNß EN CÉLULAS ß. UN MODELO PARA EL ENSAYO DE NUEVAS TERAPIAS PARA LA DIABETES TIPO 1	Metabólicas
44	C.O	Barajas	Miguel	GENE THERAPY OF ORTHOTOPIC HEPATOCELLULAR CARCINOMA IN RATS USING ADENOVIRUS CODING FOR INTERLEUKIN-12 (IL-12)	Cáncer
12	P	Barquinero Mañez	Jordi	INFLUENCE OF MYELOABLATION, GRAFT SIZE, AND EX VIVO MANIPULATION ON THE ENGRAFTMENT OF TRANSDUCED MURINE HEMATOPOIETIC CELLS	Vectores
39	P	Barroso del Jesus	Alicia	NUEVAS APLICACIONES TERAPÉUTICAS DEL RNA: UTILIZACIÓN DE RIBODECOZIMAS COMO AGENTES ANTI-VIH	Silenciamiento Génico
18	C.O	Benet Giménez	Marta	GENE CFTR TRANSFER AND PERSISTENCE OF EXPRESSION OVER TIME	Metabólicas
55	P	Berraondo López	Pedro	DISEñO Y DESARROLLO DE UNA ESTRATEGIA DE TERAPIA GENICA ANTIVIRAL FRENTE AL VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB)	Cáncer
35	C.O	Berzal Herranz	Alfredo	INGENIERÍA DE RIBOZIMAS	Silenciamiento Génico
27	P	Bosch	Fátima	LA EXPRESIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO SEMEJANTE A LA INSULINA I (IGF-I) ESPECÍFICAMENTE EN CÉLULAS ß CONTRARRESTA LA DIABETES TIPO 1	Metabólicas
31	P	Bosch	Fátima	AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD A LA INSULINA Y PREVENCIÓN DE LA OBESIDAD MEDIANTE LA EXPRESIÓN DE GLUCOQUINASA EN EL MÚSCULO ESQUELÉTICO	Metabólicas
25	P	Casado Olea	Jose A.	TIPAJE DE PACIENTES ESPAÑOLES CON ANEMIA DE FANCONI MEDIANTE TRANSDUCCIÓN DE LINFOCITOS T PERIFÉRICOS CON VECTORES RETROVIRALES.	Metabólicas
43	C.O	Casado Sáenz	Enrique	STRATEGIES TO ACCOMPLISH TARGETED EXPRESSION OF TRANSGENES IN OVARIAN CANCER FOR MOLECULAR THERAPEUTIC APPLICATION	Cáncer
51	P	Casado Sáenz	Enrique	EVALUACION PRECLÍNICA DEL PROMOTOR DE L-PLASTIN PARA DIRIGIR TRANSCRIPCIONALMENTE LA TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR ADENOVIRUS A TUMORES OVÁRICOS	Cáncer
52	P	Casado Sáenz	Enrique	UN ADENOVIRUS REPLICATIVO CONDICIONAL CON INFECTIVIDAD AUMENTADA (AdD24-RGD) PARA LA TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER DE OVARIO: EVALUACION PRECLÍNICA DE SELECTIVIDAD, POTENCIA ONCOLÍTICA Y ESTRATEGIAS DE COMBINACIÓN CON QUIMIOTERAPIA	Cáncer
42	C.O	Cascalló Piqueras	Manel	ADENOVIRUS-MEDIATED EXPRESSION OF TUMOR SUPPRESSOR GENES (p53, p16, p21 and pRb) IN HUMAN PANCREATIC CELL LINES WITH DIFFERENT PATTERN OF GENETIC ALTERATIONS	Cáncer
33	C.O	Ciudad Gómez	Carlos	EFECTO CITOTÓXICO EN CÉLULAS HUMANAS DE CÁNCER DE MAMA DE INMUNOLIPOSOMAS TRANSPORTADORES DE OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO CONTRA EL RNA PARA LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA	Silenciamiento Génico
2	C.O	Chillon	Miguel	TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIANTE VECTORES VIRALES PARA DIRIGIR LA EXPRESION DE GENES EXOGENOS A ISLOTES PANCREATICOS IN VIVO	Vectores
24	P	de Semir Frappart	David	OPTIMIZACION DE LA INCORPORACION DE QUIMERAPLASTOS PARA LA CORRECCION DE MUTACIONES PUNTUALES EN UN MODELO CELULAR DE FIBROSIS QUISTICA	Metabólicas
21	C.O	Del Río Nechaevsky	Marcela	PERMANENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA IN VIVO EN TRASPLANTES DE QUERATINOCITOS HUMANOS TRANSDUCIDOS POR VECTORES RETROVIRALES.	Metabólicas
32	C.O	Eritja	Ramon	LA ESTRATEGIA ANTISENTIDO DESDE UNA PERSPECTIVA QUIMICA.	Silenciamiento Génico
22	P	Ferrer	Aurora	IMMUNE RESPONSES TO DYSTROPHIN AFTER PLASMID DIRECT INJECTION	Metabólicas
41	C.O	Fillat Fonts	Cristina	RETROVIRUS-MEDIATED TRANSFER OF THE HERPES SIMPLEX VIRUS THYMIDINE KINASE AND CONNEXIN 26 GENES IN PANCREATIC TUMOR CELLS. IMPLICATIONS FOR GENE THERAPY	Cáncer
46	P	Fillat Fonts	Cristina	IMPACTO DE LA TRANSFERENCIA DE LOS GENES SUICIDAS CYP2B1/CPA Y HSVTK/GCV SOBRE UN MODELO DE ADENOCARCINOMA DE PÁNCREAS EXOCRINO HUMANO	Cáncer
49	P	García Castro	Javier	UN MODELO MURINO PARA EL PURGADO DE MÉDULA ÓSEA CONTAMINADA CON LEUCÉMIA MIELOMONOCÍTICA UTILIZANDO VECTORES ADENOVIRALES	Cáncer
17	C.O	Garcia Martín	Carmen	NIVELES TERAPÉUTICOS DE FACTOR VIII (FVIII) HUMANO EN RATONES IMPLANTADOS CON CÉLULAS RECOMBINANTES ENCAPSULADAS	Metabólicas
54	P	Garcia Navarro	Raquel	UTILIZACIÓN DE LA INTERLEUQUINA 12 COMO ADYUVANTE EN LA INMUNIZACIÓN GÉNICA CON ANTÍGENO DEL CORE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS DE LA MARMOTA (WHV): INDUCCIÓN DE RESPUESTA CELULAR TH1 Y PROTECCIÓN FRENTE A LA INFECCION EXPERIMENTAL CON WHV	Cáncer
47	C.O	García Ribas	Ignacio	DEMOSTRACIÓN DE SINERGIA IN VITRO ENTRE VECTORES ADENOVIRALES RECOMBINANTES PRODUCTORES DE INTERFERON g O FACTOR DE NECROSIS TUMORAL a Y AGENTES QUIMIOTERÁPICOS	Cáncer
4	C.O	Guenechea Amurrio	Guillermo	Identificación de distintas clases de células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas por su capacidad proliferativa y de automantenimiento	Vectores
5	C.O	Guillem Primo	Vicent	TRANSFERENCIA SELECTIVA DE GENES CON UN VECTOR NO VIRAL DIRIGIDO DE BASE POLIMÉRICA EN UN MODELO DE LINFOMA HUMANO.	Vectores
29	P	Hidalgo Barrera	Antonio	INCREMENTO DE LA SENSIBILIDAD A LA INSULINA MEDIANTE LA SOBREEXPRESIÓN HEPÁTICA DE c-MYC EN ANIMALES TRANSGÉNICOS	Metabólicas
13	P	Lamana Luzuriaga	Maruja	GENETIC HETEROGENEITY IN THE TOXICITY TO SYSTEMIC ADENOVIRAL GENE TRANSFER OF INTERLEUKIN-12	Tj.Somaticos
16	P	Larcher Laguzzi	Fernando	CORRECCIÓN DEL SÍNDROME DE OBESIDAD Y DIABETES DE RATONES ob/ob MEDIANTE TRASPLANTE DE QUERATINOCITOS PRODUCTORES DE LEPTINA	Tj.Somaticos
45	C.O	Lillo Rodriguez	Rosa María	ESPECIFICIDAD, EFICACIA Y SEGURIDAD DE UN SISTEMA DE PURGADO IN VIVO, PARA LA ELIMINACIÓN DE ENFERMEDAD TUMORAL RESIDUAL EN PRODUCTOS HEMATOLÓGICOS UTILIZADOS EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA	Cáncer
9	P	Martín Molina	Francisco	TRANSDUCCIÓN DE CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO MEDIANTE VECTORES LENTIVIRALES	Vectores
19	C.O	Mas	Alex	EXPRESIÓN DE INSULINA POR EL MÚSCULO ESQUELÉTICO MEDIANTE VECTORES ADENOASOCIADOS (AAV) Y ELECTROTRANSFERENCIA IN VIVO	Metabólicas
48	P	Mazzolini Rizzo	Guillermo	GENETIC HETEROGENEITY IN THE TOXICITY TO SYSTEMIC ADENOVIRAL GENE TRANSFER OF INTERLEUKIN-12	Cáncer
11	P	Moret Tatay	Inés	CHARACTERIZATION OF NONVIRAL DNA COMPLEXES.	Vectores
56	P	Municio Escurín	Maria del Mar	ENSAYOS CLÍNICOS CON TERAPIA GÉNICA	Cáncer
15	P	Muñoz Alegre	Marta	TERAPIA GÉNICA CUTÁNEA ANTIANGIOGÉNICA. PRODUCCION DE ENDOSTATINA A PARTIR DE CULTIVOS ORGANOTÍPICOS DE QUERATINOCITOS GENÉTICAMENTE MANIPULADOS.	Tj.Somaticos
37	C.O	Nadal	Anna	Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC) mediante la RNasa P humana	Silenciamiento Génico
40	C.O	Narvaiza Cuervas-Mons	Iñigo	ADENOVIRUS MEDIATED GENE TRANSFER OF INTERLEUKIN-12 (IL-12) AND INTERFERON GAMMA INDUCIBLE PROTEIN 10 (IP-10) DISPLAYS POTENT ANTITUMOR EFFECTS	Cáncer
20	C.O	Ontiveros González	María	NORMALIZACIÓN DE LA GLUCEMIA EN RATONES DIABÉTICOS TRAS TRANSPLANTE DE CÉLULAS MUSCULARES QUE EXPRESAN GLUCOQUINASA.	Metabólicas
53	P	Orive Arroyo	Gorka	INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS IN VITRO MEDIANTE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 1B5 MICROENCAPSULADAS Y SECRETORAS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI CADERINA-VE	Cáncer
6	C.O	Osta Pinzolas	Rosario	FRAGMENTO C DE LA TOXINA TETÁNICA: UN NUEVO VECTOR PARA LA TERAPIA GENICA DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS	Vectores
38	P	Rabanal	Manuel	EFECTO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO CONTRA cd4 SOBRE LINFOCITOS DE RATA TRATADOS CON PMA	Silenciamiento Génico
26	P	Rio Galdo	Paula	UNA APROXIMACIÓN EXPERIMENTAL PARA EL TRATAMIENTO GENÉTICO DE LA ANEMIA DE FANCONI.	Metabólicas
30	P	Riu	Efren	CONTRARRESTACIÓN DE LAS ALTERACIONES DIABÉTICAS MEDIANTE LA PRODUCCIÓN DE INSULINA POR EL MÚSCULO ESQUELÉTICO EN RATONES TRANSGÉNICOS	Metabólicas
34	C.O	Rodríguez-García	A.	SPECIFIC INHIBITION OF BCR-ABLP190 CELLS BY RETROVIRALLY TRANSDUCED ANTISENSE TRANSCRIPTS IN TRANSGENIC MICE	Silenciamiento Génico
1	C.O	Sánchez González	Humberto	VECTORES RETROVIRALES PARA TERAPIA GÉNICA DE SUSTITUCIÓN	Vectores
3	C.O	Segovia Sanz	Jose C	DESARROLLO DE UN NUEVO VECTOR RETROVIRAL SUICIDA PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED EN TRASPLANTE ALOGENICO DE MEDULA OSEA	Vectores
14	P	Serrano Gómez	Fernando	*hGHR A BIOSAFE SURFACE LABELLING MOLECULE FOR ANALYSIS AND SELECTION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS.	Tj.Somaticos
7	C.O	Tros de Ilarduya Apaolaza	María Concepción	EFFICIENT GENE DELIVERY BY IMPROVED TRANSFERRIN-LIPOPLEXES	Vectores
8	P	Vera	M.	DESARROLLO DE VECTORES SV40 RECOMBINANTES PARA SU USO EN TERAPIA GENICA	Vectores

I REUNIÓN DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE TERAPIA GÉNICA (S.E.T.G)

VALENCIA, 21-22 FEBRERO 2001

Pintor Sorolla, 25 3º

Fax. +34 96 352 27 43

MIÉRCOLES 21/02/2001

Salvador F. Aliño (Departamento de Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia)

16:15 Identificación de distintas clases de células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas por su capacidad proliferativa y de automantenimiento

SYMPOSIUM FUNDACIÓN MARCELINO BOTÍN

17.45-19.45 SESIÓN: TERAPIA GÉNICA DE TEJIDOS SOMÁTICOS

17:45 ADVANCES IN THE GENE THERAPY OF HEMATOPOIETIC STEM CELL DISEASES.

Juan A. Bueren. Departamento de Biología Celular, Molecular y Terapia Génica. CIEMAT y Fundación Marcelino Botín para Terapia Génica. Madrid.

JUEVES: 22/02/2001

11:00 12-30 SESIÓN: SILENCIAMIENTO GÉNICO

Ramon Eritja. Instituto de Biología Molecular de Barcelona, C.S.I.C. Barcelona.

12:15 Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC) mediante la RNasa P humana

Anna Nadal. Departamento de Medicina Interna-Hepatología, Hospital Vall d'Hebrón, Barcelona.

SYMPOSIUM FUNDACIÓN BBVA

Ignacio García Ribas. Department of Cancer Research/ICRF Unit. St Thomas Hospital. Londres. UK.

VECTORES NO VIRALES EN TERAPIA GÉNICA

Salvador F. Aliño

Conferencia 3.

ADVANCES IN THE GENE THERAPY OF HEMATOPOIETIC STEM CELL DISEASES

Conferencia 7

GENE THERAPY OF MONOGENIC DISEASES: HEMOPHILIA AS A MODEL

COMUNICACIONES

Comunicación 1

Comunicación 4

Identificación de distintas clases de células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas por su capacidad proliferativa y de automantenimiento

EFFICIENT GENE DELIVERY BY IMPROVED TRANSFERRIN-LIPOPLEXES

C. Tros de Ilarduya ^a, M.A. Arangoa^a and N. Düzgünes ^b

Comunicación 10

Supported by CICYT grants SAF99-0109.

Ramon Eritja

Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC)

mediante la RNasa P humana

Comunicación 45

Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC)

EFFICIENT GENE DELIVERY BY IMPROVED TRANSFERRIN-LIPOPLEXES

I REUNIÓN DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE TERAPIA GÉNICA (S.E.T.G)

VALENCIA, 21-22 FEBRERO 2001

Pintor Sorolla, 25 3º

Fax. +34 96 352 27 43

MIÉRCOLES 21/02/2001

Salvador F. Aliño (Departamento de Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia)

16:15 Identificación de distintas clases de células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas por su capacidad proliferativa y de automantenimiento

SYMPOSIUM FUNDACIÓN MARCELINO BOTÍN

17.45-19.45 SESIÓN: TERAPIA GÉNICA DE TEJIDOS SOMÁTICOS

17:45 ADVANCES IN THE GENE THERAPY OF HEMATOPOIETIC STEM CELL DISEASES.

Juan A. Bueren. Departamento de Biología Celular, Molecular y Terapia Génica. CIEMAT y Fundación Marcelino Botín para Terapia Génica. Madrid.

JUEVES: 22/02/2001

11:00  12-30 SESIÓN: SILENCIAMIENTO GÉNICO

Ramon Eritja. Instituto de Biología Molecular de Barcelona, C.S.I.C. Barcelona.

12:15 Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC) mediante la RNasa P humana

Anna Nadal. Departamento de Medicina Interna-Hepatología, Hospital Vall d'Hebrón, Barcelona.

SYMPOSIUM FUNDACIÓN BBVA

Ignacio García Ribas. Department of Cancer Research/ICRF Unit. St Thomas Hospital. Londres. UK.

VECTORES NO VIRALES EN TERAPIA GÉNICA

Salvador F. Aliño

Conferencia 3.

ADVANCES IN THE GENE THERAPY OF HEMATOPOIETIC STEM CELL DISEASES

Conferencia 7

GENE THERAPY OF MONOGENIC DISEASES: HEMOPHILIA AS A MODEL

COMUNICACIONES

Comunicación 1

Comunicación 4

Identificación de distintas clases de células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas por su capacidad proliferativa y de automantenimiento

EFFICIENT GENE DELIVERY BY IMPROVED TRANSFERRIN-LIPOPLEXES

C. Tros de Ilarduya a, M.A. Arangoa a and N. Düzgünes b

Comunicación 10

Supported by CICYT grants SAF99-0109.

Ramon Eritja

Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC)

mediante la RNasa P humana

Comunicación 45

Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C (VHC)

EFFICIENT GENE DELIVERY BY IMPROVED TRANSFERRIN-LIPOPLEXES

11:00 12-30 SESIÓN: SILENCIAMIENTO GÉNICO

Ignacio García Ribas. Department of Cancer Research/ICRF Unit. St Thomas Hospital. Londres. UK.

C. Tros de Ilarduya ^a, M.A. Arangoa^a and N. Düzgünes ^b